Автореферат диссертации по болезни ньюкаслом

  • автор:

Автореферат диссертации по болезни ньюкаслом

На правах рукописи

Усачёв Евгений Валерьевич

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ И СОПРЕДЕЛЬНЫХ ГОСУДАРСТВ.

03.00.03.-молекулярная биология ОЗ.ОО.Об.-вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в НИИ Вирусологии имени Д.И. Ивановского Российской Академии Медицинских наук

Кандидат биологических наук Алексей Геннадьевич Прилипов Доктор биологических наук, профессор Светлана Сергеевна Ямншсова

Доктор биологических наук, профессор Гараев Мансур Мухамедович Доктор ветеринарных наук, профессор

Владимир Иванович Смоленский

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита состоится « 5 » декабря 2005 г. в часов на заседании

диссертационного Совета Д.001.020.01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН (адрес: 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН

Автореферат разослан « 3 » 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

Доктор медицинских наук Н. П. Косякова

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы.

Вирус болезни Ньюкасла (ВБН) широко распространен в различных регионах мира, поражает многие виды диких и домашних птиц и внесён в список наиболее важных патогенов. Несмотря на проведение повсеместной вакцююпрофилактики, болезнь Ньюкасла до последнего времени остается массовой инфекцией птиц, трудно поддающейся контролю. С развитием промышленного птицеводства это заболевание приобрело панзоотический характер, нанося огромный экономический ущерб отрасли. Немаловажную роль в этом процессе сыграл широкий международный обмен высокопродуктивными породами домашних птиц, часто проводимый без учета эпизоотической ситуации в конкретных странах (Sonoda et al., 2000, Yu et al., 2001).

Вирус болезни Ньюкасла является оболочечным со спиральным строением нуклеокапсида. Геном вируса представляет собой однонитевую РНК негативной полярности протяжённостью более 1,5×104 н.о. и содержит шесть последовательно расположенных генов, кодирующих белки NP (нуклеопротеин), Р (фосфопротеин), М (матриксный белок), F (белок слияния), HN (гемагглютинин-нейраминидазу) и L (РЖ-зависимую РНК-полимеразу).

Стремительное накопление экспериментальных данных показывает

огромное генетическое разнообразие вируса БН. К сожалению, в настоящий

момент не существует общепринятой системы классификации вируса в

пределах рода Avulavirus (Mayo, 2002). Среди наиболее известных систем

классификации ВБН выделяются две, основанные на анализе участка гена F. По

классификации, предложенной авторами Lomniczi et al. (1998), Alexander et al.

(1999), Herczeg et al. (1999, 2001), Ke et al. (2001), Yu et al. (2001), Liang et al.

(2002) существует восемь основных линий (I-VIII). Другая система,

предложенная Aldous et al. (2003, 2004), предполагает наличие всего шести

ОСНОВНЫХ ЛИНИЙ 1-6. В данной ряблте ппя у?тянпигтрнна . ГвНОТИПОВОЙ

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ i БИБЛИОТЕКА I

принадлежности исследованных штаммов ВБН мы основывались на второй системе классификации.

Несмотря на то, что филогенетический анализ выполнен для огромного числа штаммов ВБН по всему миру и определены основные генотипы, остаётся неясным вопрос — какие генотипы ВБН представлены на территории России и сопредельных государств. Из известных "российских" изолятов ВБН к моменту написания работы в базе данных вепВапк были представлены частичные нуклеотидные последовательности гена Б только четырёх представителей субтипов За, ЗЬ и 4а, выделенных с 1947 по 1974 гг. от домашней птицы (Грибанов с соавт., 1999; Манин с соавт., 2002). Однако совершенно не изучено разнообразие вариантов штаммов БН, циркулирующих в популяциях диких птиц.

Для детекции вируса болезни Ньюкасла в образцах органов птиц, а также аллантоисной жидкости куриных эмбрионов в настоящее время разработаны несколько ОТ-ПЦР систем. В основном, все они основаны на амплификации участка гена Р или М. Как правило, они адаптированы к штаммам, выделенным на определённой территории, а постоянное накопление фактического материала (в данном случае речь идёт о первичных нуклеотидных последовательностях генов штаммов ВБН) сужает область применения данной системы. Поэтому, из-за недостатка данных по распространению генотипов ВБН на территории России и сопредельных государств, необходимо создать ОТ-ПЦР систему для детекции РНК вируса БН, адаптированную к вариантам вируса, циркулирующего на территории нашей страны. Для оптимизации ранее предложенных методов детекции мы считали целесообразным создать систему выявления вирусного генома на основе ОТ-ПЦР анализа с последующим использованием амплифицированных фрагментов ДНК для секвенирования и выяснения филогенетических взаимоотношений исследуемых вариантов ВБН с ранее известными.

Для наиболее полной характеристики штамма вируса, необходимо знать полную нуклеотидную последовательность его генома. К настоящему моменту

такие данные о штаммах, выделенных на территории России и сопредельных государств, отсутствуют. Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования явилась генетическая характеристика вариантов вируса болезни Ньюкасла (ВБН), циркулирующих на территории России и сопредельных государств в популяциях домашних и диких птиц, а также определение первичной структуры генома варианта вируса БН, наиболее распространённого на территории России. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Провести определение первичной структуры гена F или его участка "культуральных" штаммов вируса БН (всего 59), выделенных на территории России (11), Украины (3), Белоруссии (1) и Казахстана (44) от диких и домашних птиц в период с 1983 по 2004 г.

2. Разработать лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР системы на основе анализа нуклеотидных последовательностей известных штаммов ВБН, депонированных в базе данных GenBank.

3. Испытать разработанную детекционную систему на образцах полевого материала (182), собранного от диких птиц на территории Приморского края в 2004 г.

4. Провести генотипирование исследуемых штаммов вируса и вариантов из полевого материала, а также сравнить их между собой и с ранее охарактеризованными штаммами, представленными в базе данных GenBank, с помощью филогенетического анализа.

5. Определить первичную структуру полную генома российского штамма Sterna/Astrakhan/2755/2001 вируса БН субтипа 5Ь.

6. Провести корреляционный анализ соответствия результатов генотипирования по фрагменту гена F (374 н.о.) и результатов генотипирования по практически полному геному.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Создан и апробирован лабораторный вариант ОТ-ПЦР тест-системы для детекции вируса БН.

2. Установлено, что на территориях Астраханской области (2002 г.) и Приморского края России (2001-2004 гг.) в популяциях диких птиц циркулировали варианты вируса БН генотипа 1, а также субтипов За и 5Ь.

3. Установлено, что выделенные от домашней птицы штаммы ВБН на территории Казахстана в эпизоотический и межэпизоотический периоды с 1988 по 2004 гг. принадлежат к генотипам 1,2, а также субтипам За, 5Ь и 5с1.

4. Установлено, на основании анализа аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния, что все изученные штаммы и изоляты, отнесённые к субтипам За, 5Ь и 5(1, соответствуют велогенному характеру патогенности, в то время как варианты вируса БН генотипов 1 и 2 -лентогенному характеру патогенности.

5. Продемонстрировано, что за эпизоотическую ситуацию в обследованных регионах отвечает циркуляция штаммов ВБН, принадлежащих субтипам 5Ь, 5с1 и За. Учитывая, что последние эпизоотии в Казахстане были вызваны вирусами в основном субтипа 5Ь, а также то, что именно этот субтип преобладает в популяциях диких птиц, обитающих на территории России, данный субтип представляет наибольшую опасность для птицеводческих хозяйств России и сопредельных государств.

6. Генетически охарактеризован, на основе определённой нами первичной структуры генома, первый российский велогенный штамм 81ета/Ав1гакЬап/2755/2001 вируса БН, принадлежащий субтипу 5Ь.

7. Проведённый анализ соответствия результатов генотипирования по фрагменту гена Б (374 н.о. от начала открытой рамки считывания белка Р — по классификации А1ёош с соавт., 2003) и результатов генотипирования по практически полному геному показал высокую степень их корреляции (К=0,98). Таким образом, показано правомерное использование участка гена Б

(374 н.о.) для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода Avulavirus и внутри основных генетических линий.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Создан лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР системы, позволяющий обнаружить различные варианты вируса БН, циркулирующие на территории России и сопредельных государств. С помощью данной системы обнаружены варианты вируса БН четырёх основных генетических линий из шести, известных к настоящему времени.

2. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей участка гена F (374 н.о.) штаммы ВБН, изолированные на территории России и сопредельных государств, принадлежат к генотипам 1 и 2, а также субтипам За, 5Ь и 5d.

3. Анализ аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния позволил установить, что на территории России и Казахстана циркулируют штаммы как велогенного, так и лентогенного патотипов. Штаммы различной степени патогенности встречаются как среди домашних, так и диких птиц.

4. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома российского штамма вируса БН, который также оказался первым представителем субтипа 5Ь с известной первичной структурой генома. Установленная полная нуклеотидная последовательность генома штамма Sterna/Astrakhan/2755/2001 вируса болезни Ньюкасла позволяет использовать его в качестве эталонного представителя субтипа 5Ь с велогенным патотипом.

5. Сравнение результатов филогенетического анализа по участку гена F и последовательности практически полного генома ВБН показало высокую степень их корреляции (К=0,98). Полученные данные позволяют сделать заключение о правомерном использовании участка гена F (374 н.о.) для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода Avulavirus и внутри основных генетических линий.

Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН (29.09.05).

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 122 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (121 источник), содержит 8 таблиц и 24 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве исследуемого материала были использованы штаммы ВБН, выделенные на территории России (11) и Казахстана (44), а также четыре штамма из коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, изолированные на территории Украины и Белоруссии от домашней птицы.

Штаммы из России, исследованные в данной работе, были изолированы в Костромской обл., Астраханской обл. и в Приморском крае, как от диких (10), так и от домашних птиц (1). Штаммы, выделенные в Казахстане, были изолированы от домашних птиц за период с 1988-2004 гг. на территории Алматинской, Жамбылской и ТалдыкорганскоЙ областей.

Также в работе были исследованы 182 образца полевого материала (клоакальные смывы птиц) собранные на юге Приморского края в 2004 г. от диких (142) и домашних птиц (40).

Последовательность олигонуклеотидных праймеров подбиралась с помощью программы Primer Premier 5.00 (Premier Biosoft International, США) с использованием нуклеотидных последовательностей различных изолятов ВБН, доступных в базе данных GeneBank. Определение нуклеотидных последовательностей осуществляли на автоматическом секвенаторе (ABI

PRISM 3100, США). Для построения алайментов использовали пакет программ DNASTAR V.3.12 (Lasergene, США). Построение филогенетических деревьев осуществляли на основе двух алгоритмов: "ближайшего соседа" или "UPGMA" в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 1000-кратным ресэмплингом (MEGA 2.1).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Создание лабораторного варианта ОТ-ПЦР тест-системы для детекции РНК вируса БН в биологических образцах

Одной из задач данной работы было создание детекционной ОТ-ПЦР тест-системы для обнаружения геномной РНК вируса БН, совмещённой с определением генотиповой принадлежности ПЦР-положительных образцов на основе сюсвенса амплифицируемых фрагментов ДНК.

Для синтеза на матрице вирусной РНК комплиментарной ДНК был подобран праймер 614F. Место посадки этого праймера расположено в районе З'-конца гена М (рис. 1А). Для детекции вируса БН в пробах полевого материала с очень низким содержанием вирусной РНК применялся вариант "гнездовой" ПЦР: внешняя пара праймеров 614F/1356R (рис. 1С); внутренняя пара 1045F/601R (рис. 1D). Для амплификации фрагментов ДНК культуральных штаммов ВБН с целью их дальнейшего генотипирования применялся однораундовый или "полу-гнездовой" варианты ПЦР в зависимости от концентрации вирусной РНК в пробе. Однораундовый вариант ПЦР проводили с участием пары 614F/3232R (рис. 1В). В "полу-гнездовом" варианте ПЦР использовали пары праймеров: внешняя 614F/3232R (рис. 1В) и внутренняя пара 614F/1356R (рис. 1С).

Разработанная ОТ-ПЦР система была протестирована на культуральных штаммах вируса БН, а также образцах полевого материала (Приморский край, 2004 г.). Важно отметить, что в нашем распоряжении не было штаммов всех известных шести генотипов вируса БН (APMV-1) и штаммов других

парамиксовирусов птиц (АРМУ-2 — АРМУ-9), ввиду чего, не было возможности проверить универсальность и специфичность ОТ-ПЦР системы.

Однако, при анализе первичной структуры генома ранее охарактеризованных штаммов (вепБапк), можно сделать заключение о возможности использования предложенной нами ОТ-ПЦР системы для обнаружения всех известных к настоящему времени генотипов вируса БН в пределах рода Ауи1аутз.

В ат*> 1-ы* раунд ПЦР 3239

С «иг 19ИВ 2-ой раунд ПЦР дпмфм 1-ый раунд

0 юп детекция 2-о* раунд ПЦР

Рисунок 1. Схематическое изображение ОТ-ПЦР тест-системы ВБН для проб с высоким и низким содержанием вируса (см. в тексте), а также стратегии секвенирования. А-Б — стадии ОТ-ПЦР тест системы. Е — стадия секвенирования амплифицированных фрагментов ДНК. Стрелками обозначены направления олигонуклеотидных праймеров.

2. Генетическая характеристика штаммов ВБН, выделенных на территории России и сопредельных государств 2.1. Исследование штаммов ВБН, изолированных на территории России, Украины и Белоруссии

Вирусы, изолированные в Астраханской области

На основе филогенетического анализа по участку гена Б (по системе, предложенной АМоив с соавторами в 2003 г.) штаммы ВБН, изолированные в

Астраханской обл. в 2001 г., были отнесены нами к субтипу 5Ь (рис. 2) в составе европейского кластера. Исследуемые астраханские штаммы были выделены от диких птиц, являющихся основным резервуаром ВБН. По-видимому, циркуляция именно этого генотипа определяет современную эпизоотическую ситуацию на территории северо-западного Прикаспия. Вирусы, изолированные на территории Украины, Белорусии и Костромской области России

Для штаммов СЫскепЖлеуЛ 033/83, СЫскеп/Юеу/2082/83, Е)иск/икгате/376/87, СЫскеп/Ве1агш/1/86 и Оиск/Коз1г/25/86 была определена нуклеотидная последовательность целого гена Б (порядка 1700 и.о.). Филогенетический анализ этих штаммов по участку гена Р показал, что "украинские" штаммы принадлежат к второму генотипу, а штаммы из Белоруссии и Костромской области к первому (рис. 2). Нами было установлено, что штаммы СЫскеп/Ве1агиз/1/86 и Оиск/КоБй725/86 в пределах первого генотипа входят в состав западноевропейского кластера. Штаммы, изолированные в Приморском крае в 2001-2002 гг.

Для штаммов Оиск/РагЕаз1/2713/2001, Оиск/РагЕаз1/2686/2001, Шск/БагЕазг/2687/2001, Апаз/РагЕаз1/3658/2002, Апаз/РагЕаБУЗ638/2002 и Апаз/РагЕаэ^З652/2002, выделенных от диких птиц в Приморском крае в 20012002 гг., была определена нуклеотидная последовательность целого гена Р. На основе филогенетического анализа по участку гена Р эти штаммы были отнесены к первому генотипу. Следует отметить, что приморские штаммы вошли также как, и штаммы СЫскеп/Ве1агиз/1/86 и Е>иск/Козгг/25/86, в западноевропейский кластер.

2.2. Анализ штаммов ВБН, изолированных от домашних птиц в Казахстане в 1988-2004 гг.

Для штаммов ВБН, изолированных в птицеводческих хозяйствах Казахстана с 1988 по 2004 гг., была определена нуклеотидная последовательность протяжённостью 1083 и.о., охватывающая участок гена М

(100 а.о., С-конец белка М), расстояние между кодирующими последовательностями генов М и V и начало гена Р (206 а.о., №конец белка Р). Пятнадцать штаммов 1998 года, два штамма 2000 г. и три штамма 2001 г. были отнесены к субтипу 5Ь. Пять штаммов 2003 г. и столько же 2004 г. отнесены к субтипу 5с!. Десять штаммов более ранних лет изоляции отнесены к первому генотипу (1988 г. — 2 штамма, 1989 г. — 3 штамма и 1998 г. — 5 штаммов). Три штамма, выделенные в Жамбылской области (1 — 1988 г. и 2 — 1990 г.) были отнесены к субтипу За. Один штамм 2001 г. ПМВ-1/курица/Алматы/93/01 принадлежал к второму генотипу (рис. 2). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей участка гена Р казахстанских штаммов в пределах субтипа 5Ь показал, что штаммы 1998-2001 гг. входят в состав европейского кластера. Штаммы, вошедшие в первый генотип, оказались генетически однородными и наиболее близкими к ранним изолятам: СЫскеп/Ве1аги!з/1/86 и Шск/Коз1г/25/86, принадлежащим к штаммам западноевропейского кластера. Исследуемые в данной работе "казахстанские" штаммы 2003-2004гг., по-видимому, образуют собственный кластер в пределах субтипа 5«1. Три казахстанских штамма, отнесённые к субтипу За, оказались наиболее близкими к штаммам ГАМ-61, \iukteswar и сингапурским штаммам -БССК99062 и -8(>СК99061 1999 г. Непатогенные или слабопатогенные варианты ВБН к настоящему времени в составе субтипов 5Ь и 5(1 не описаны.

Исходя из этого, можно предположить, что циркуляция высокопатогенных штаммов субтипов 5Ь и 5с) определяет современную эпизоотическую ситуацию на территории Казахстана. По-видимому, за последние 3-4 года произошла смена вариантов вируса БН субтипа 5Ь на субтип 5с1.

ПМВ> 1/курим/Алм*ты/2ДО8 ПМВ-1/куряца/Алияты/24/98 ПМВ-1/куряца/Алматы/26ДО ПМВ-1/куряца/Алматы/28Л> ПМВ-1/куряияМлматы/30/98 ПМВ-1/курш1а/Ал»шты/31/98 ПМВ-1/курти/Алматы/32/98 ПМВ-1/курица/Алиаты/34/98 ПМВ-1/курица/Алиаты/ЗбОД ПМВ-1/курши/Алшты/37/98 ПМВ-1/курнца/Алматы/38/98 ПМВ-1/куряця/Ал»Иты/39/98 ПМВ*1/куряпа/Алиаты/42/98 ПМВ-1/куриц1/Алыаты/43/98 ПМВ-1/куряца/Алмяты/52/98 ПМВ-1Леуряца/Алматы/55/00 ПМВ-1/куряца/Алматы/61/00 ПМВ-1/кур»па/Ко«ыр/ШЛ11 ПМВ-1/куриид/Коиыр/127/01 ПМВ-1/курпп/Ктыр/12М1

Sttrna/Ajtrakhin/2755/2001 Stcrna/AstraUiaa/2758/2001 CorBorant/AitrakJiaa/2751/200I Coot/Ailr.khin/2743/2001

ПМВ-1/курии«/1'аллыкорг«н/341Л)3 ПМВ-1/курнца/Гадаыкорга11/342Л>3 ПМВ-1/курнца/Галдыкоргян/343/03 ПМВ-1/курни1/Галдыкорг»н/344/03 ПМ1Ы/куряЦя/Талды1соргЯ11/34£Л)3 ПМВ-1/курнца/Алматы/540/О4 ПМВ-1/курнца/Алиаты/541/04 ПМВ-1/курнпа/Алматы/542/04 ПМВ-1/куряш/Алматы/ЯЗЛМ ПМВ-икурта/Ллжггы/MS/M

ПМВ-1/курица/Алматы/352/88 ПМВ-1/индюк/Жамбш1/536/90 ПМВ-1/курица/Жамбыл/353/90

Chiclien/Kiev/Í033/83 Chickeo/Kiev/2082/83 Oack/lfkraiBe/376/87 ПМИ/курица/АлматыЛЗЛП

Duck/FarEait/2713/2001 Diclc/FarEaft/2686/2001 DHck/FarEast/2687/2001 Aaaa/Far£Mt/3658/2002 Anaj/FarEast/3638/2002 Anai/FarEalt/3«52/M02

ПМВ-1/куряца/Алм*ты/244/88 ПМВ-1/куряца/Алматы/345/88 ПМВ- 1/кур*ца/Алматы/449/89 ПМВ-1/куряоа/Алматы/462/89 ПМВО/курнца/Ал маты/469/89 ПМВ- 1/куряца/Алм«ты/29Л8 ПМВ-1/курноа/Алматы/33/98 ПМВ-1/курица/Алматы/35/98 ПМВ-1/курица/Алматы/47/98 ПМВ-1/курнца/АстЯна/51/98 Chfcken/Bclanu/I/86 Dnclt/Koitr/25/М

Рисунок 2. Генотиповая принадлежность исследованных штаммов (в прямоугольниках). Овалами обозначены генетические группы. Генотипы обозначены цифрами от 1 до 6, а субтипы буквами от а до е. Филогенетический анализ с использованием нуклеотидных последовательностей участка гена F длиной 374 н.о. проводили на основе алгоритма «ближайшего соседа» в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 1000-кратным ресэмплингом (MEGA 2,1).

3. Изучение генетического разнообразия вируса БН, циркулировавшего среди диких и домашних птиц в Приморском крае в

Полевой материал, собранный в Приморском крае в 2004 г., был исследован с помощью созданной ОТ-ПЦР тест-системы для детекции РНК ВБН непосредственно в клоакальных смывах. Общая зараженность ВБН

диких птиц составила 7 /142 « 4.9 %. Общая зараженность домашних птиц -1 / 40 = 2.5 %. На основе филогенетического анализа по участку гена Р два образца из восьми положительных были нами отнесены к 1-му генотипу, один — к субтипу За, пять — к субтипу 5Ь.

Образцы, содержащие РНК ВБН первого генотипа (Ргш04-61-Р и Ргт04-64-Р), оказались генетически однородными и наиболее близкими к ранее описанным "казахстанским" штаммам первого генотипа, принадлежащим к штаммам западноевропейского кластера.

Анализ нуклеотидных последовательностей изолятов Ргш04-14-Р, Ргш04-22-Р, Ргт04-83-Р, Ргт04-94-Р и Ргт04-169-Р, отнесённых к субтипу 5Ь, показал, что первые четыре образца ближе всего к штаммам Казахстана 1998 г., входящим в состав европейского кластера. Последний образец также вошёл в европейский кластер, но в составе группы из "казахстанских" штаммов (2000 и 2001 гг.) и "астраханских" штаммов 2001 г.

Единственный образец Ргт04-129-Р, отнесённый к субтипу За, оказался наиболее близок к штаммам ПМВ-1/курица/Алматы/352/88, ПМВ-1/индюк/Жамбыл/536/90 и ПМВ-1/курица/Жамбыл/553/90, изолированным в Казахстане.

4. Филогенетические взаимоотношения исследуемых изолятов ВБН в пределах генетических групп

Сравнение исследованных штаммов ВБН и ПЦР-положительных образцов, отнесённых к первому генотипу, с ранее описанными штаммами этого же генотипа по участку гена Р, позволило установить их более детальную дифференциацию. Исследованные штаммы Виск/Козгг/25/86 и СЫскеп/Ве1агиз/1/86, изоляты из Казахстана 1988-1998 гг., а также изоляты Приморского края (2004 г.) Ргт04-61-Р и Ргт04-64-Р образовали довольно однородную группу, удалённую от группы штаммов Приморского края 20012002 гг., в пределах западноевропейского кластера первого генотипа.

Установлено, что в популяциях диких птиц Приморского края циркулируют штаммы ВБН первого генотипа, по меньшей мере, двух вариантов. Генотип 2.

В пределах генотипа 2 рядом авторов выделяется четыре чётких кластера штаммов ВБН (Alexander, 2000; Давыдкин с соавт., 2001). Два из них -кластеры вакцинных штаммов, родоначальником первого является штамм LaSota, а второго — В1. Третий кластер представляют штаммы с велогенным и мезогенным характером патогенности. Четвёртый кластер составляют всего три штамма евразийского континента с лентогенным характером патогенности.

Из исследованных в данной работе штаммов к генотипу 2 нами были отнесены три штамма с Украины 1980-х гг. и один штамм Казахстана 1991 г., выделенные от домашней птицы. Более детальный анализ нуклеотидных последовательностей гена F или его участка позволил сделать вывод, что исследованные штаммы являются вариантами вакцинного штамма LaSota, широко применяющегося в птицеводческих хозяйствах и входят в состав кластера вакцинных штаммов ряда LaSota. Следует также отметить, что нами не были обнаружены варианты вакцинных штаммов второго генотипа в популяциях диких птиц, что, по-видимому, свидетельствует о низкой эффективности трансмиссии этих штаммов от дикой к домашней птице. Субтип За.

Субтип За составляют штаммы мезогенного и велогенного патотипов. Некоторые мезогенные штаммы этой группы используются в качестве вакцинных в птицеводческих хозяйствах. Исследованные штаммы и образцы (ПМВ-1 /индюк/Жамбыл/536/90, ПМВ-1/курица/Жамбыл/553/90, ПМВ-1/курица/Алматы/З52/88 и Prm04-129-P), отнесённые к этому субтипу, оказались наиболее близкими к сингапурским штаммам -SGCK99062 и -SGCK99061, а также к вакцинным аттенуированным штаммам Mukteswar (BINLA40166) и ГАМ-61. Можно предположить, что исследованные штаммы Казахстана и один из изолятов Приморского края 2004 г. могут быть

вариантами вакцинного штамма или эндемичными штаммами обследованных регионов. Отсутствие сведений об использовании вакцинных вариантов вируса БН в этих регионах не позволяет сделать заключение о возможности интродукции вакцинного варианта вируса субтипа За в популяции диких птиц. Субгип 5Ь.

Анализ исследованных штаммов ВБН и "ОТ-ПЦР положительных" образцов, отнесённых к субтипу 5Ь по участку гена И, позволил установить их более детальную классификацию в пределах генотипа. Рядом авторов субтип 5Ь считается генетически гетерогенным, и в его пределах выделяются четыре различных кластера (АЫош й а1., 2003). Первый кластер, состоит в основном из штаммов ВБН, изолированных в Европе в середине 1990-х гг. Второй кластер представлен штаммами, выделенными на африканском континенте также в середине 1990-х гг. Третий кластер (самый малочисленный) состоит из трёх португальских изолятов и одного болгарского (1993-1998 гг.). Четвёртый кластер представлен неклассифицированными (возможно

кластерообразующими) штаммами различного географического происхождения (Азия, Южная Америка и Европа) и сроком выделения с 1982 по 1994 г.

Исследованные штаммы ВБН и изоляты, отнесённые нами к субтипу 5Ь, вошедшие в состав европейского кластера, можно разделить на две отдельные генетические группы. В первую группу попали штаммы Казахстана 2000 и 2001 гг., штаммы Астраханской обл. 2001 г. и один ПЦР-положительный образец Приморского края 2004 г. Во вторую группу вошли казахстанские штаммы 1998 г. и четыре варианта вируса из Приморского края 2004 г.

Установлено, что в популяциях диких птиц Приморского края в 2004 г. циркулировали штаммы ВБН субтипа 5Ь, по меньшей мере, двух вариантов. Штаммы ВБН двух вариантов субтипа 5Ь были также изолированы на территории Казахстана во время эпизоотий с 1998 по 2001 гг.

Учитывая то обстоятельство, что на территории Казахстана в 1998 г. преобладали варианты вируса второй группы, а в 2000-2001 гг. варианты первой группы субтипа 5Ь, можно предположить, что в период с 1998 г. по 2000

г. произошла смена вариантов вируса БН субтипа 5Ь, циркулирующего среди домашней птицы на территории Казахстана. Субтип 5(1.

В состав субтипа 5с1 входят штаммы ВБН, изолированные в азиатской части Евразийского континента, и их разделяют на два кластера. В первый кластер входят штаммы, преимущественно выделенные в Тайване в период с 1998 г. по настоящий момент. Второй кластер составляют штаммы, изолированные в Китае и Средней Азии (АМоив Л а1., 2003).

Среди изученных нами к субтипу 5(1 были отнесены только казахстанские штаммы 2003 и 2004 гг. При построении филогенетического древа данные штаммы образовали отдельную ветвь, практически равноудалённую от ветвей двух ранее описанных кластеров этого субтипа. На основании этого можно предположить, что казахстанские штаммы образуют свой самостоятельный генетический кластер.

Исходя из представленных выше данных можно сделать вывод, что в период с 1998 г. по 2000 г. произошла смена вариантов вируса БН второй группы субтипа 5Ь на варианты вируса первой группы, а с 2001 г. по 2003 г. в популяции ВБН произошла интродукция вариантов нового кластера субтипа 5(1. Таким образом, совместная циркуляция штаммов ВБН субтипов 5Ь и 5<1 будет определять современную эпизоотическую ситуацию в Казахстане и на сопредельных территориях.

5. Анализ сайта расщепления белка Р исследуемых изолятов ВБН

Протеолитическое нарезание бежа Р0 является неотъемлемой и важной частью жизненного цикла вируса БН. Нарезание белка Р0 приводит к его активации (проявлению биологической активности), необходимой в процессе слияния вирусной и клеточной мембран. Как полагают, эффективность протеолиза белка Ро, опосредованная аминокислотной последовательностью сайта нарезания, является одним из главных маркеров инфекционности и патогенности вируса БН. Низкопатогенные и некоторые вакцинные штаммы

ВБН имеют следующую аминокислотную последовательность сайта расщепления F-протеина: 109SGGG(R/K)QGRLIG119, в то время как высокопатогенные штаммы содержат последовательность

109SGGRRQ(K/R)RF(V/I)G 119. Последняя включает пару основных аминокислот в положениях 115 и 116, фенилаланин в позиции 117 и аргинин в позиции 113, что обеспечивает эффективность расщепления клеточными протеазами и модулирует вирулентность на молекулярном уровне. Анализ аминокислотных последовательностей сайта протеолитического расщепления белка F исследованных изолятов позволил предположить, что все обследованные варианты ВБН 1-го и 2-го генотипов слабопатогенны и имеют последовательность сайта нарезания белка F0 [SGGG(K/R)QGRL1G], а вирусы субтипов За, 5Ь и 5d — высокопатогенны и содержат последовательность [SGGRRQRRFIG]. При этом необходимо отметить, что штаммы различной степени патогенности встречаются как у домашней, так и у дикой птицы.

б. Анализ первичной структуры полного генома штамма ВБН Sterna/Astrakhan/2755/2001

К началу проведения данной работы было известно 27 полноразмерных последовательностей вирусного генома ВБН, представителей генотипов 1, 2 и субтипов ЗЬ, Зс, 4а, 4Ь, 5а и 5d. В процессе выполнения данной работы стали известны ещё три последовательности практически полного генома представителей генотипа 6. Также нужно отметить, что в базе данных не было представлено ни одной полноразмерной нуклеотидной последовательности генома вируса, выделенного на территории России.

Для определения полной нуклеотидной последовательности генома был выбран штамм Sterna/Astrakhan/2755/2001. Принадлежность этого штамма к субтипу 5Ь по участку гена F была установлена нами ранее, что облегчило дальнейшую стратегию подбора праймеров для проведения реакций ОТ, ПЦР и секвенирования фрагментов генома. После реакций ОТ-ПЦР были получены три перекрывающихся фрагмента ДНК, составляющие вирусный геном.

Полученные фрагменты ДНК были использованы для определения полной нуклеотидной последовательности генома исследуемого штамма. Определённая нами нуклеотидная последовательность генома штамма 81егпа/АБ1гакЬап/2755/2001 длиной 15154 н.о. (без 39 3'-концевых н.о.) была депонирована в базе данных СепВапк (АУ865652).

Реальная картина филогенетических взаимоотношений изучаемых штаммов ВБН возможна лишь при анализе нуклеотидных последовательностей полного генома всех существующих вариантов вируса. Однако определение последовательности полного генома вируса является очень трудоёмким и дорогостоящим процессом. Поэтому исследователями для установления филогенетических взаимоотношений штаммов вируса используются последовательности различных участков генома, так или иначе отображающих реальную картину филогении вируса. В связи с этим, нами была предпринята попытка сравнения результатов филогенетического анализа по практически полноразмерным последовательностям генома и аналогичного анализа по участку гена Р (374 и.о., согласно классификации АЫоив с соавторами, 2003 г.). Сравнение данных этих анализов по разным фрагментам генома показало их высокую степень корреляции (К=0,98), что позволяет сделать заключение о правомерности использования данного участка гена Р для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода и внутри основных генетических линий.

На основании анализа первичной структуры генома исследованного штамма 81егпа/АБ1:гакЬап/2755/2001 и штаммов с известными биологическими свойствами, а также молекулярно-генетических признаков патогенности (аминокислотный состав вирусных белков, последовательность сайта протеолитической активации белка Р0 и белка НИ, кратность геномной РЖ шести нуклеотидным остаткам, наличие биологически активного белка V) был установлен его велогенный характер патогенности.

Isolate I-2progeri1or I»lMtl-2

Mixed species/U S7LBrgo^71

Anhmga/U S (FI)/44083/93

isolate 99-0655 bótale 99-1435 Isolate 99-0868k> Isolate 99-0868hi Isolate 99-1997PR-32 Isolate 91-1252 Isolate 02-1334 Isolate 98-1154 Isolate 98-1249 Isolate 01-1108

Ош*/1Ш154979-1/2001 Duct/US Л19535-1/2001 Chidcen/U S./101250-2/2001

Gamefowl/U S (САУ211472/02

Рисунок 3. Филогенетическое древо штаммов с известным полным геномом. Филогенетический анализ с использованием нуклеотидных последовательностей длиной 11902 н.о. проводили на основе алгоритма «ближайшего соседа» в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 1000-кратным ресэмплингом (MEGA 2.1). Разделение на генотипы и субтипы по участку гена F, основанное на системе Aldous с соавторами 2003 г.

1. Установлено, что разработанный лабораторный вариант ОТ-ПЦР тест-системы является эффективным для детекции геномной РНК вируса болезни Ньюкасла (ВБН) разных генотипов в биологических образцах, включая полевые. С помощью разработанной системы, на основании анализа 59

штаммов ВБН, выделенных в различных географических регионах (Россия, Казахстан, Белоруссия и Украина) от домашних и диких птиц, были выявлены четыре из шести известных к настоящему времени генотипов.

2. Определена первичная структура участка гена Р (374 н.о.) для 67 изученных вариантов ВБН и выявлено генетическое разнообразие вирусов (генотипы 1, 2, 3 и 5), циркулировавших на территории России и сопредельных государств в период с 1983 по 2004 г.

3. На основе филогенетического анализа по участку гена Р установлена генотиповая принадлежность вирусов БН, циркулировавших в популяциях диких птиц на территории России: в Астраханской обл. выявлены представители субтипа 5Ь, в то время как в Приморском крае России обнаружены варианты вируса первого генотипа и субтипов За и 5Ь.

4. Установлено, что среди домашней птицы на территории Казахстана в эпизоотический и межэпизоотический периоды с 1988 по 2004 гг. циркулировали штаммы вируса БН генотипов 1 и 2, а также субтипов За, 5Ь и5ё.

5. Выявлены различия в аминокислотных последовательностях сайта протеолитической активации белка Р0 у исследованных вариантов ВБН разных генотипов. Последовательность [8СЮО(К/К)(Х>К1ЛО] вариантов вируса БН генотипов 1 и 2 соответствует лентогенному (слабопатогенному) характеру патогенности, тогда как последовательность [8СХ5Ш101и1РЮ] субтипов За, 5Ь и 5(1 ВБН характерна для велогенных (высокопатогенных) штаммов.

6. Впервые определена первичная структура генома (>1,5×104 н.о.) российского велогенного штамма ВБН 81егпа/Аз1гакЪап/2755/2001. Отсутствие данных о полной нуклеотидной последовательности генома других представителей субтипа 5Ь позволяет рассматривать его в качестве прототипного для этого субтипа.

7. На основе выявленной высокой степени корреляции данных филогенетического анализа по участку гена Р (374 н.о.) и данных

аналогичного анализа по фрагменту генома протяженностью II902 и.о. (К=0,98), сделано заключение о правомерном использовании указанной части гена F для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода Avulavirus и внутри основных генетических линий.

Список работ по теме диссертации.

1. Bogoyavlenskiy A., Berezin V., Prilipov A., Usachev Е., Lyapina О., Levandovskaya S., Korotetskiy I., Tolmacheva V., Makhmudova N., Khudyakova S., Tustikbaeva G., Zaitseva I., Omirtaeva E., Ermakova O., Daulbaeva K., Asanova S., Kydyrmanov A., Sayatov M., King D. Molecular Characterization of Virulent Newcastle Disease Virus Isolates from Chickens during the 19988 NDV Outbreak in Kazakhstan. // Virus Genes. — 2005. — V.31. — P. 13-20.

2. E.B. Усачёв, И.Т. Федякина, М.Ю. Щелканов, Д.Н. Львов, А.Г. Прилипов, С.С. Ямникова. Молекулярно-генетическая характеристика вируса болезни ньюкасла Sterna/Astrakhan/2755/2001 изолированного в России // Мол. Ген. Микробиол. Вирусол. — 2006. — №1. — в печати.

3. Bogoyavlenskiy A., Berezin V., Prilipov A., Usachev Е., Lyapina О., Levandovskaya S., Korotetskiy I., Tolmacheva V., Makhmudova N., Khudyakova S., Tustikbaeva G., Zaitseva I., Omirtaeva E., Ermakova O., Daulbaeva K., Asanova S., Kydyrmanov A., Sayatov M., King D. Частичные нуклеотидные последовательности гена F штаммов ВБН, депонированные в GenBank. AY847361, AY847360, AY847359, AY847358, AY847357, AY847356, AY847355, AY847354, AY847353, AY847352.

4. Usachev E.V. and Prilipov A.G. Нуклеотидные последовательности целого гена F штаммов ВБН, депонированные в GenBank. AY965079, AY965078, AY965077, AY972103, AY972102, AY972101.

РНБ Русский фонд

Заказ №571. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Усачев, Евгений Валерьевич

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ф 1.1. Классификация возбудителя.

1.2. Молекулярно-биологическая характеристика вируса болезни Ньюкасла.

1.2.1. Структура вириона.

1.2.2. Геном вируса и кодируемые им белки.

1.2.2.1. ИР — нуклеокапсидный белок.

1.2.2. 2. Белки, кодируемые геном Р.

1.2.2.2.а. Фосфопротеин (Р). ф 1.2.2.2.Ъ. Белки

1.2.3. Протеолитическая активация белка слияния.

1.2.4. Адсорбция и проникновение вируса в клетку.

1.2.5. Репликация генома вируса БН.

1.2.6. Транскрипция мРНК вируса БН.

1.2.7. Сборка вирионов вируса БН. ф 1.3. Молекулярно-генетические основы патогенности вируса болезни

1.4. Детекция и типирование штаммов ВБН.

Глава 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Анализируемые штаммы из базы данных ОепВапк.

2.2. Исследуемые штаммы.

2.3. Места сбора и объем полевых материалов в Приморском крае в * 2004 г.

2.4. Олигонуклеотиды использованные в экспериментах.

2.5. Выделение РНК.

2.6. Реакция обратной транскрипции (ОТ).

2.7. Проведение полимеразной цепной реакции.

2.8. Определение 5'-концевой последовательности геномной РНК.

2.9. Электрофорез ДЕК.

2.10. Приготовления ДНК для секвенирования.

2.11. Секвенирование ДНК.

2.12. Построение алайментов и филогенетический анализ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Создание лабораторного варианта ОТ-ПЦР тест-системы для детекции РНК вируса БН в биологических образцах.

3.2. Генетическая характеристика штаммов ВБН, выделенных на территории России и сопредельных государств.

3.2.1. Исследование штаммов ВБН, изолированных на территории России, Украины и Белоруссии.

3.2.2. Анализ штаммов ВБН, изолированных от сельскохозяйственных птиц в Казахстане в 1988-2004 гг.

3.3. Изучение генетического разнообразия вируса БН, циркулировавшего среди диких птиц и домашних в Приморском крае в 2004 г.

3.4. Филогенетические взаимоотношения исследуемых штаммов ВБН и ПЦР-положительных образцов в пределах генетических групп.

3.5. Анализ сайта расщепления белка F исследуемых штаммов и ПЦР-положительных образцов.

3.6. Анализ полного генома штамма ВБН Sterna/Astrakhan/2755/2001.

Введение Диссертация по биологии, на тему «Генетическая характеристика штаммов вируса болезни Ньюкасла, выделенных на территории России и сопредельных государств»

Вирус болезни Ньюкасла (ВБН) или APMV-1 (Avian Paramyxovirus 1) принадлежит к семейству парамиксовирусов (Paramyxoviridae), подсемейству Paramyxovirinae, роду Avulavirus [70,71]. Семейство парамиксовирусов включает ряд вирусов, вызывающих опасные заболевания человека и животных, среди них особенно печально известны такие вирусы, как вирус кори

Впервые вспышки болезни Ньюкасла (БН) среди домашней птицы были зарегистрированы на Индонезийском острове Ява и собственно в Ньюкасле в 1926 году [103]. На сегодняшний день вирус БН широко распространен в различных регионах мира, поражает многие виды диких и домашних птиц и внесён в список наиболее важных патогенов (лист А). Несмотря на проведение повсеместной вакцинопрофилактики, болезнь Ньюкасла до последнего времени остается самой массовой инфекцией птиц, трудно поддающейся контролю. С развитием промышленного птицеводства это заболевание приобрело пандемический характер, нанося огромный экономический ущерб отрасли. Немаловажную роль в этом процессе сыграл широкий международный обмен высокопродуктивными породами домашних птиц, часто проводимый без учета эпизоотической ситуации в конкретных странах [109, 120].

За последние 80 лет множество эпизоотических вспышек БН нанесли удар по птицеводческой индустрии многих стран, причём некоторые из них переросли в форму панзоотии. Полагается, что первая панзоотия началась в середине 1920-х гг. и утихла только в конце 1950-х гг., когда стала распространённой вакцинация. О развитии второй панзоотии имеются две версии. Согласно одной она началась на Дальнем Востоке в начале 1960-х гг. и распространилась до Европы через Ближний Восток. Другая версия предполагает, что вторая панзоотия имеет южноамериканское происхождение в результате импорта экзотических птиц (попугаев) в Европу и Северную Америку [11, 47, 69]. Инфекция почтовых голубей вариантом вируса БН (PPMV-1) в конце 1970-х гг. на Ближнем Востоке ознаменовала начало третьей панзоотии, которая к настоящему моменту охватила многие страны всего мира. В настоящий момент, несмотря на проведение вакцинации практически повсеместно, существует опасность возникновения новой панзоотии.

Лавинообразное накопление экспериментальных данных показывает огромное генетическое разнообразие вируса БН. К сожалению, в настоящий момент не существует общепринятой системы классификации вируса в пределах рода. Среди наиболее известных систем классификации ВБН выделяются две, основанные на анализе участка гена F. По системе, предложенной авторами Lomniczi et al. (1998), Alexander et al. (1999), Herczeg et al. (1999, 2001), Ke et al. (2001), Yu et al. (2001) существует восемь основных линий (I-VIII) [69, 15, 49, 50, 57, 120]. Другая система, предложенная Aldous et al. (2003, 2004), предполагает наличие всего шести основных линий 1-6 [9, 10].

Несмотря на то, что филогенетический анализ выполнен для огромного числа штаммов ВБН по всему миру и определены основные генотипы, остаётся неясным вопрос — какие генотипы ВБН представлены на территории России и сопредельных государств. Из известных "российских" изолятов ВБН к моменту написания работы в базе данных GenBank были представлены частичные нуклеотидные последовательности гена F только четырёх представителей генотипов За, ЗЬ и 4а, выделенных с 1947 по 1974 гг. от домашней птицы [3, 6]. Однако совершенно не изучено разнообразие вариантов штаммов БН, циркулирующих в популяциях диких птиц.

В связи с повсеместно расширяющейся программой вакцинации, начавшейся в начале 1950-х гг. и увеличивающимся числом вакцинных вариантов вируса, возникает вопрос о возможности выплеска вакцинных штаммов в популяции диких птиц и об их дальнейшей судьбе.

Для детекции вируса болезни Ньюкасла в образцах органов птиц, а также аллантоисной жидкости куриных эмбрионов в настоящее время разработаны несколько ОТ-ПЦР систем. В основном, все они основаны на амплификации участка гена Б или М. Как правило, они адаптированы к штаммам, выделенным на определённой территории, а постоянное накопление фактического материала (в данном случае речь идёт о первичных нуклеотидных последовательностях генов штаммов ВБН) сужает область применения данной системы. Поэтому, из-за недостатка данных по распространению генотипов ВБН на территории России и сопредельных государств, необходимо создать ОТ-ПЦР систему для детекции РНК вируса БН адаптированную к вариантам вируса, циркулирующего на территории нашей страны. Для оптимизации ранее предложенных методов детекции мы считали целесообразным создать систему выявления вирусного генома на основе ОТ-ПЦР анализа с последующим использованием амплифицированных фрагментов ДНК для секвенирования и выяснения филогенетических взаимоотношений исследуемых вариантов ВБН с ранее известными.

Для наиболее полной характеристики штамма вируса, необходимо знать полную нуклеотидную последовательность его генома. К настоящему моменту данные о штаммах, выделенных на территории России и сопредельных государств, отсутствуют.

Цель и задачи исследования.

Целью, настоящего исследования явилась генетическая характеристика вариантов вируса болезни Ньюкасла (ВБН), циркулирующих на территории России и сопредельных государств в популяциях домашних и диких птиц, а также определение первичной структуры генома варианта вируса БН, наиболее распространённого на территории России. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Провести определение первичной структуры гена Б или его участка "культуральных" штаммов вируса БН (всего 59), выделенных на территории России (11), Украины (3), Белоруссии (1) и Казахстана (44) от диких и домашних птиц в период с 1983 по 2004 г.

2. Разработать лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР системы на основе анализа нуклеотидных последовательностей известных штаммов ВБН, депонированных в базе данных ОепВапк.

3. Испытать разработанную детекционную систему на образцах полевого материала (182), собранного от диких птиц на территории Приморского края в 2004 г.

4. Провести генотипирование исследуемых штаммов вируса и вариантов из полевого материала, а также сравнить их между собой и с ранее охарактеризованными штаммами, представленными в базе данных ОепВапк, с помощью филогенетического анализа.

5. Определить первичную структуру полную генома российского штамма 81егпа/Аз1гак11ап/2755/2001 вируса БН субтипа 5Ь.

6. Провести корреляционный анализ соответствия результатов генотипирования по фрагменту гена Б (374 н.о.) и результатов генотипирования по практически полному геному.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Создан и апробирован лабораторный вариант ОТ-ПЦР тест-системы для детекции вируса БН.

2. Установлено, что на территориях Астраханской области (2002 г.) и Приморского края России (2001-2004 гг.) в популяциях диких птиц циркулировали варианты вируса БН генотипа 1, а также субтипов За и 5Ь.

3. Установлено, что выделенные от домашней птицы штаммы ВБН на территории Казахстана в эпизоотический и межэпизоотический периоды с 1988 по 2004 гг. принадлежат к генотипам 1, 2, а также субтипам За, 5Ь и 5<±

4. Установлено, на основании анализа аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния, что все изученные штаммы и изоляты, отнесённые к субтипам За, 5Ь и 5с1, соответствуют велогенному характеру патогенности, в то время как варианты вируса БН генотипов 1 и 2 — лентогенному характеру патогенности.

5. Продемонстрировано, что за эпизоотическую ситуацию в обследованных регионах отвечает циркуляция штаммов ВБН, принадлежащих субтипам 5Ь, 5(1 и За. Учитывая, что последние эпизоотии в Казахстане были вызваны вирусами в основном субтипа 5Ь, а также то, что именно этот субтип преобладает в популяциях диких птиц, обитающих на территории России, данный субтип представляет наибольшую опасность для птицеводческих хозяйств России и сопредельных государств.

6. Генетически охарактеризован, на основе определённой нами первичной структуры генома, первый российский велогенный штамм 81ета/Аз1га1<±.ап/2755/2001 вируса БН, принадлежащий субтипу 5Ь.

7. Проведённый анализ соответствия результатов генотипирования по фрагменту гена Б (374 н.о. от начала открытой рамки считывания белка Б -по классификации АЫош с соавт., 2003) и результатов генотипирования по практически полному геному показал высокую степень их корреляции (К=0,98). Таким образом, показано правомерное использование участка гена Б (374 н.о.) для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода Ауи1ау1гиз и внутри основных генетических линий.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Создан лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР системы, позволяющий обнаружить различные варианты вируса БН, циркулирующие на территории России и сопредельных государств. С помощью данной системы обнаружены варианты вируса БН четырёх основных генетических линий из шести, известных к настоящему времени.

2. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей участка гена Б (374 н.о.) штаммы ВБН, изолированные на территории России и сопредельных государств, принадлежат к генотипам 1 и 2, а также субтипам За, 5Ь и 5с1.

3. Анализ аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния позволил установить, что на территории России и Казахстана циркулируют штаммы как велогенного, так и лентогенного патотипов. Штаммы различной степени патогенности встречаются как среди домашних, так и диких птиц.

4. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома российского штамма вируса БН, который также оказался первым представителем субтипа 5Ь с известной первичной структурой генома. Установленная полная нуклеотидная последовательность генома штамма 81егпа/Аз1гакЬап/275 5/2001 вируса болезни Ньюкасла позволяет использовать его в качестве эталонного представителя субтипа 5Ь с велогенным патотипом.

5. Сравнение результатов филогенетического анализа по участку гена Б и последовательности практически полного генома ВБН показало высокую степень их корреляции (К=0,98). Полученные данные позволяют сделать заключение о правомерном использовании участка гена Б (374 н.о.) для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода А\чйа\чгы8 и внутри основных генетических линий.

Заключение Диссертация по теме «Молекулярная биология», Усачев, Евгений Валерьевич

Среди иарамиксовирусов птиц вирус болезни Ньюкасла (АРМУ-1) считается, пожалуй, самым распространённым и наносит огромный

• экономический ущерб народному хозяйству. К настоящему моменту известен факт четырёх панзоотий ВБН, причём четвёртая продолжается в настоящее время в популяциях голубей разных видов и вызвана циркуляцией вируса генотипа 4Ь.

Из всех известных классификаций вируса БН в пределах рода Ауи1ау1гш наиболее широко используемыми являются две, предложенные Ьотшсг1 et а1. (1998) и АШош а1. (2003). Они основаны на филогенетическом анализе участка гена Б. Накопление данных по

• нуклеотидным последовательностям различных участков генома разных штаммов ВБН происходит лавинообразно. Не вызывает сомнения очевидность необходимости типирования вновь охарактеризованных штаммов для создания более полной картины генетического разнообразия циркулирующих вариантов вируса на той или иной территории с целью проведения эффективной вакцинации. Однако проведению качественной вакцинопрофилактики в нашей стране мешают несколько факторов:

1. Отсутствие данных о циркуляции генетических вариантов вируса БН на территории России и стран, через которые пролегают пути миграции птиц, обитающих на территории России;

• 2. Отсутствие жёсткого контроля за закупкой кормов и племенной птицы;

3. Отсутствие контроля за применением вакцинных штаммов;

4. Отсутствие вакцинации домашней птицы в малых хозяйствах и подворьях.

К моменту выполнения данной работы в базе данных ОепВапк были представлены только четыре представителя генотипов За, ЗЬ и 4а л выделенные в России с 1947 по 1974 гг. от домашней птицы [3,6].

В связи с этим была предпринята попытка типирования российских штаммов БН последних лет, выделенных на территории Астраханской области и Приморского края от диких птиц (главных точек пересечения путей миграции диких птиц), нескольких более ранних штаммов из музея вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского, а также казахстанских штаммов от домашней птицы. Кроме культуральных штаммов были обследованы образцы полевого материала (клоакальные смывы 142 диких птиц и 40 домашних птиц), собранные в Приморском крае в 2004 г.

Для осуществления задуманного нами был создан лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР тест . системы. Для подбора олигонуклеотидных праймеров мы проводили сравнение различных участков генома разных штаммов ВБН, представленных в базе данных ОепВапк. Важно отметить, что к моменту выполнения данной работы в базе данных отсутствовали нуклеотидные последовательности представителей шестого генотипа. Поэтому разработанная ОТ-ПЦР система может не отличаться высокой универсальностью и специфичностью. Однако, теоретически, на основе алайментов нуклеотидных последовательностей, соответствующих местам посадки праймеров, можно предположить, что с помощью данной системы можно будет детектировать в вируссодержащих пробах представителей вируса БН, по меньшей мере, пяти генотипов из шести, известных к настоящему моменту.

С помощью созданной ОТ-ПЦР системы были получены фрагменты ДНК участка гена Б всех исследуемых российских и казахстанских штаммов. Кроме того, для большинства российских штаммов были получены фрагменты ДНК целого гена Б, а для всех казахстанских фрагмент ДНК длиной 1083 н.о., охватывающий участок гена М (100 а.о. С-конец), расстояние между кодирующими последовательностями генов М и Б и начало гена Б (206 а.о.). При анализе 182 образцов полевого материала, собранного в Приморском крае в 2004 г. был получен фрагмент ДНК участка гена Б вируса БН только для 8 образцов. Общая зараженность птиц вирусом

БН составила 4,4 %, а в частности диких — 4,9 %. Для последующего филогенетического анализа нами была определена нуклеотидная последовательность фрагментов ДНК штаммов ВБН и ПЦР-положительных образцов. Нуклеотидные последовательности практически всех российских штаммов были депонированы нами в базу данных ОепВапк.

На основе филогенетического анализа по участку гена Б в пределах рода Ал>и1атгт была установлена генотиповая принадлежность исследуемых штаммов и ПЦР-положительных образцов. Российские штаммы были отнесены нами к генотипам 1, 2, и 5Ь. Разнообразие генотипов среди казахстанских штаммов оказалось несколько большим (генотипы 1, 2, За, 5Ь и 5(1). Среди ПЦР-положительных образцов Приморского края 2004 г. были обнаружены представители генотипов 1, За й 5Ь.

На основе филогенетического анализа по участку гена Б в пределах обнаруженных генотипов мы установили более подробные генетические взаимоотношения исследуемых штаммов. В пределах первого генотипа исследуемые изоляты были отнесены нами к западноевропейскому кластеру, причём приморские штаммы 2000-2001 гг. выделения образовали отдельную группу от группы казахстанских штаммов 1988-1998 гг. и приморских ПЦР-положительных образцов 2004 г. Поскольку этот генотип распространён по всему миру и среди него встречаются в основном лентогенные варианты, то можно считать исследованные изоляты эндемичными вариантами вируса БН, характерными для данных территорий.

Внутри второго генотипа исследуемые штаммы отошли к кластеру вакцинных штаммов ряда Ьа8о1а. Все эти штаммы были выделены от домашней птицы, и с большой вероятностью они являются генетическими вариантами широко применяющегося вакцинного штамма Ьа8о1а.

Среди представителей генотипа За невозможно было провести более подробную кластеризацию в виду малого количества известных штаммов. Однако исследованные казахстанские штаммы и один приморский образец оказались генетически однородными и довольно близкими аттенуированному вакцинному штамму ГАМ-61. Исходя из этого, можно предположить, что они могут быть вариантами этого вакцинного штамма или эндемичными штаммами обследованных регионов. Недостаток знания об использовании вакцинных вариантов вируса БН в этих регионах не позволяет сделать заключение о происхождении исследуемых штаммов, и идёт ли речь об интродукции вакцинного варианта вируса в популяции диких птиц.

История выявления представителей пятого генотипа насчитывает около двадцати лет на территориях почти всех континентов, кроме Австралии и Северной Америки. Существует опасность занесения представителей этого генотипа на территорию последних двух. Это может ознаменовать начало пятой панзоотии. Причём, вызвана она, может быть совместной циркуляцией всех субтипов этой генетической линии, но основная роль, по-видимому, будет за генотипом 5Ь.

Исследуемые штаммы и образцы, отнесённые нами к этому генотипу, вошли в состав европейского кластера, при этом разбившись на две отдельные группы. В первую группу вошли казахстанские штаммы выделения 2000-2001 гг., астраханские штаммы 2001 г. и один образец Приморского края 2004 г. Вторую группу образовали казахстанские штаммы 1998 г. и четыре образца Приморского края 2004 г. Все представители генотипа 5Ь, известные к настоящему моменту, имеют велогенный характер патогенности. Все исследуемые казахстанские штаммы этого генотипа были выделены в эпизоотические периоды от домашней птицы, а российские штаммы и образцы от дикой птицы. Из чего можно заключить, что преимущественно циркуляция вируса БН генотипа 5Ь в настоящее время определяет эпизоотическую ситуацию в данных регионах.

Интересным оказался факт интродукции эпизоотических штаммов ВБН генотипа 5с1 на территорию обследованных областей Казахстана в период с 2001 г. по 2003 г. В пределах этой генетической линии, исследованные штаммы, по-видимому, образуют собственный кластер среди ранее выделенных кластеров: 1 — штаммов из Китая и Ближнего Востока и 2 штаммов, выделенных на Тайване. Из чего можно заключить: на эпизоотическую ситуацию в Казахстане и близлежащих территориях России также будет иметь влияние циркуляция штаммов ВБН этого генотипа.

Молекулярно-генетический анализ главного маркера патогенности вируса БН — аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния позволил установить, что все исследованные штаммы ВБН и ПЦР-положительные образцы, относящиеся к генотипам За, 5Ь и 5(1 имеют последовательность этого сайта соответствующую велогенному патотипу. Штаммы ВБН и ПЦР-положительные образцы, относящиеся к генотипам 1 и 2, имеют последовательность сайта активации, соответствующую лентогенному патотипу.

Следует отметить, что к началу данной работы было опубликовано всего 27 полноразмерных последовательностей вирусного генома представителей генотипов 1, 2, ЗЬ, Зс, 4а, 4Ь, 5а и 5с1. Позднее были опубликованы три последовательности практически полного генома представителей генотипа 6. Также нужно отметить, что в базе данных не было опубликовано ни одной полноразмерной нуклеотидной последовательности генома отечественного изолята. Для определения полной нуклеотидной последовательности генома российского изолята вируса БН был взят штамм 81егпа/Аз1гак11ап/2755/2001. Нуклеотидная последовательность полного генома первого российского штамма ВБН была зарегистрирована нами в базе данных ОепВапк [АУ865652].

Реальная картина филогенетических взаимоотношений изучаемых штаммов ВБН возможна лишь при анализе нуклеотидных последовательностей полного генома всех существующих вариантов вируса. Однако определение последовательности полного генома вируса является очень трудоёмким и дорогостоящим процессом. Поэтому исследователями для установления филогенетических взаимоотношений штаммов вируса используются последовательности различных участков генома, так или иначе отображающих реальную картину филогении вируса. В связи с этим, нами была предпринята попытка сравнения результатов филогенетического анализа по практически полноразмерным последовательностям генома и аналогичного анализа по участку гена Б (374 и.о., согласно классификации АМош с соавторами, 2003 г.). Сравнение данных этих анализов по разным фрагментам генома показало их высокую степень корреляции (К=0,98), что позволяет сделать заключение о правомерности использования данного участка гена Б для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода Ауи1см1гш и внутри основных генетических линий.

На основании анализа первичной структуры генома исследуемого штамма 81егпа/Аз1так]1ап/275 5/2001 и штаммов с известными биологическими свойствами, а также молекулярно-генетических признаков патогенности (аминокислотный состав вирусных белков, последовательность сайта протеолитической активации белка Бо и белка НИ, кратность геномной РНК шести нуклеотидным остаткам, наличие биологически активного белка V) был установлен его велогенный характер патогенности.

  • Усачев, Евгений Валерьевич
  • кандидата биологических наук
  • Москва, 2005
  • ВАК 03.00.03

Авторефераты диссертаций по инфекционным болезням

Генетическое разнообразие и фармакодинамическое обоснование прогноза резистентности к антимикробным препаратам нозокомиальных штаммов Acinetobacter spp. в различных регионах России и Беларуси
Мартинович Алексей Александрович

Документ в формате PDF (576 Кб)

Фармакоэпидемиологические аспекты лечения внебольничной пневмонии в амбулаторной практике
Рачина Светлана Александровна

Документ в формате PDF (230 Кб)

Фармакодинамическое обоснование повышения эффективности аминогликозидов при лечении грам(-) госпитальных инфекций
Решедько Галина Константиновна

Документ в формате PDF (216 Кб)

Фармакоэкономическая оптимизация применения антибиотиков в абдоминальной хирургии
Розенсон Олег Леонидович

Документ в формате PDF (220 Кб)

Оптимизация антибиотикотерапии нозокомиальных инфекций, вызванных Klebsiella pneumoniae, в стационарах России
Рябкова Елена Леонидовна

Документ в формате PDF (392 Кб)

Оптимизация диагностики и антибактериальной терапии гонореи у женщин
Сехин Сергей Владимирович

Документ в формате PDF (259 Кб)

Зависимость фармакодинамических параметров антибиотиков от условий определения чувствительности бактериальных возбудителей внебольничных и госпитальных инфекций
Стецюк Ольга Ульяновна

Документ в формате PDF (217 Кб)

Фармакоэпидемиология лекарственных средств у беременных
Стриженок Елена Александровна

Документ в формате PDF (280 Кб)

Этиологическое значение различных микроорганизмов при хронических простатитах
Сухорукова Марина Витальевна

Документ в формате PDF (382 Кб)

Особенности клинической картины и обоснование выбора антибиотиков при остром бактериальном синусите различной этиологии
Тарасов Александр Анатольевич

Документ в формате PDF (359 Кб)

Оптимизация антибиотикотерапии нозокомиальных инфекций, вызванных Acinetobacter baumannii, в отделениях реанимации и интенсивной терапии России
Фаращук Александр Николаевич

Документ в формате PDF (336 Кб)

Оптимизация мониторинга потребления антимикробных препаратов для системного применения на региональном уровне
Фокин Александр Александрович

Документ в формате PDF (200 Кб)

Оптимизация антибактериальной терапии внебольничных инфекций мочевыводящих путей у детей
Шевелев Алексей Николаевич

Документ в формате PDF (172 Кб)

Оптимизация антибактериальной терапии инфекций мочевыводящих путей у пациентов с сахарным диабетом
Хайкина Елена Витальевна

Документ в формате PDF (320 Кб)

Разработка молекулярно генетических методов для выявления и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae
Эйдельштейн Инна Александровна

Документ в формате PDF (885 Кб)

Разработка молекулярно-генетических методов для исследования β-лактамаз TEM- и SHV-типа у клинических штаммов энтеробактерий
Эйдельштейн Михаил Владимирович

Документ в формате PDF (636 Кб)

Известно, что у больных ВИЧ-инфекцией наблюдается стеатоз печени (Bonnet. Е. 2007,Hadigan С, 2007, 2008). Дислипидемия является общим метаболическим нарушением среди ВИЧ-инфицированных, получавших ингибиторы протеаз, на основе противовирусной терапии (Hiransuthikul N., 2007…

Сохраняющееся во многих странах мира неблагополучие по бруцеллезу обусловливает все ещё высокую заболеваемость этой инфекцией среди людей. При этом официальные статистические данные, публикуемые ВОЗ, ниже истинных приблизительно в 5 раз, так как иностранными исследователями эти показатели объясняются отсутствием достаточных лабораторных…

Установлено, что острые кишечные инфекции разной этиологии способствуют изменению микроэкологии не только биотопа кишечника, но и биотопа наружных гениталий. Изменения носят сочетанный однонаправленный характер…

До настоящего времени нет единого мнения о пороговом уровне виремии, являющимся показанием к противовирусной терапии. Большинство американских экспертов ориентируются на уровень HBV в крови — 20 000 МЕ/мл (100 000 копий/мл) при назначении ПВТ, в то время как, европейские эксперты предложили считать критерием для назначения терапии более низкие…

Впервые исследован характер нарушений липидного обмена у больных хроническим гепатитом С в период обострения в зависимости от активности воспалительного процесса, генотипа вируса и вирусной нагрузки. Определено, что транспортная система холестерина является более чувствительной при развитии цитолиза в период обострения ХГС и изменяется быстрее…

Выше изложенное определило большой интерес к эпидемиологическим особенностям парентеральных вирусных гепатитов на территории с высокими показателями заболеваемости, с конкретными социально-эпидемиологическими особенностями…

Этиотропная терапия этой инфекции находится в стадии разработки и не лишена недостатков. Имеются сведения о снижении вирусной нагрузки, уменьшении проявлений интоксикации, геморрагического синдрома и ОПН в результате применения рибавирина. Однако, возможность применения данного препарата у больных ГЛПС ограничивается его эффективностью только при…

Поражение сердца при Лайм-боррелиозе — актуальная и малоизученная проблема. Часто, в связи с отсутствием настороженности врачей терапевтов и кардиологов, боррелиозные поражения сердца протекают под масками других диагнозов. Вместе с тем, несвоевременная диагностика и лечение Лайм-кардита могут приводить к развитию ремоделирования миокарда и…

Иммунологические показатели через 4-12 месяцев и 3-7 лет после окончания терапии существенно не различаются (за исключением CD95+ клеток) и не отличаются от возрастной нормы, что определяет возможность вакцинации через 4 месяца ремиссии. Дополнительная ревакцинация позволяет сформировать защитные антитела к паротиту и гепатиту В у 100% привитых…

Научная новизна исследования: В работе установлено, что дети со злокачественными заболеваниями вне зависимости от числа ранее проведенных прививок и давности окончания терапии становятся серонегативными или имеют низкие титры антител к кори, паротиту, гепатиту В соответственно в 83,3, 85,4 и 69,2…

К настоящему времени накоплен большой клинический и экспериментальный материал, указывающий на способность ассоциации патогенов кардинально изменять форму и структуру инфекционного1 процесса: приводить к его манифестации или, наоборот, латентному состоянию, менять клиническую картину заболевания. Закономерности течения микст-инфекции вирусных…

В то же время особенности иммунного дисбаланса у больных гемоконтактными гепатитами, инфицированных при использовании наркотиков внутривенно, влияние длительности приема психоактивных веществ и возраста больных на характер иммунологических изменений остаются малоизученными. Вышеизложенное послужило основанием для проведения настоящего…

Неблагополучная эпидемиологическая обстановка в РФ по заболеваемости вирусными гепатитами была связанна с экологическими и социально-экономическими факторами, которые способствовали увеличению хронических вялотекущих заболеваний, развитию иммунодефицитных и иммунопатологических состояний, интенсивному распространению наркомании, болезней…

Наиболее пораженными оказались лица: 20-24 лет (показатель заболеваемости 27,0 на 100 тыс.), 25-29’лет (показатель заболеваемости 24,0 на 100 тыс. населения). У 71,3% от общего количества заболевших — употребление сырой воды и у 29,7%- контакт с больными гепатитом А…

В Свердловской области в 2004 — 2006 годах заболеваемость дизентерией держится в пределах 29,4 — 42,49 — 40,1 на 100 тысяч населения, из них 67,1 — 74,5 % составляет шигелла Флекснера 2а (Медведева Т.А. с соавт., 2003, 2006; Государственный доклад «О санитарно — эпидемиологической обстановке в Свердловской области за 2006 год…

Научная новизна работы Установлена тенденция к более частому развитию кардиальных осложнений дифтерии у лиц из организованного закрытого коллектива (на примере военнослужащих срочной службы) в сравнении с взрослым гражданским населением Архангельской области того же возраста (за 20 лет наблюдения). Определена роль прививочного анамнеза в выявлении…

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ Впервые на репрезентативном, лабораторно подтвержденном материале изучены закономерности распространения хантавирусной инфекции, выявлена прямая корреляционная связь между уровнем естественного иммунитета и заболеваемостью ГЛПС в конкретном регионе, показаны особенности клинического течения и…

Несмотря на определенные достижения в изучении иммунобиологии ка-лицивирусов человека, многие стороны иммунопатогенеза как норовирусной, так и саповирусной инфекции также остаются неясными. Тяжесть течения заболевания, санация организма от вируса во многом определяется иммунным ответом макроорганизма на внедрение возбудителя. Клеточный иммунитет к…

Основной причиной неудовлетворительной диагностики является отставание во внедрении в практику работы учреждений здравоохранения современных методов диагностики актуальных ОКИ…

Киртадзе Ираклий Демуриевич. — Влияние социальных детерминант на состояние здоровья и качество жизни населения старших возрастных групп (Автореферат) (4.07.2019)

Лудупова Евгения Юрьевна. — Научно-организационные принципы построения территориальной системы управления качеством медицинской деятельности (Автореферат) (4.07.2019)

Искандаров Ильдар Раушанович. — Совершенствование организации неотложной первичной медико-санитарной помощи (на примере крупного промышленного города) (Автореферат) (30.05.2019)

Радзиховская Маргарита Владимировна. — Совершенствование организации медицинской помощи пациентам с ВИЧ-инфекцией на региональном уровне (Автореферат) (30.05.2019)

Костикова Анна Юрьевна. — Мотивация и удовлетворенность профессиональной деятельностью медицинских работников (Автореферат) (25.04.2019)

Зафирова Василиса Баисиевна. — Научное обоснование совершенствования мер профилактики туберкулеза на региональном уровне (Автореферат) (25.04.2019)

На заседании 25 апреля 2019 года диссертационный совет принял отрицательное решение по диссертации Зафировой В.Б.

Федяева Анна Владимировна. — Методические подходы к планированию объемов медицинской помощи, оказываемой в амбулаторных условиях, пациентам с новообразованиями (Автореферат) (28.03.2019)

Денисов Мелсик Спартакович. — Репродуктивное здоровье девушек-студенток: медико-статистические особенности, факторы риска, проблемы охраны (комплексное медико-социальное исследование по материалам Чувашской Республики) (Автореферат) (28.02.2019)

Бабкин Юрий Сергеевич. — Социально-гигиенические и медико-организационные аспекты совершенствования санаторно-курортного лечения пациентов с болезнями мужских половых органов (Автореферат) (24.01.2019)

Бережков Дмитрий Владимирович. — Совершенствование деятельности медицинской организации частной системы здравоохранения, участвующей в реализации территориальной программы обязательного медицинского страхования (Автореферат) (27.12.2018)

Шестопалова Татьяна Николаевна. — Методические принципы формирования стандартных операционных процедур медицинской деятельности (Автореферат) (27.12.2018)

Лапина Лариса Михайловна. — Совершенствование информационного обеспечения управления качеством организации медицинской помощи (Автореферат) (29.11.2018)

Шкитин Сергей Олегович. — Научное обоснование совершенствования организации и оценки качества медицинской помощи при сердечно-сосудистой патологии (Автореферат) (29.11.2018)

Илларионова Елена Викторовна. — Совершенствование управления стационарной оториноларингологической помощью (Автореферат) (25.10.2018)

Кравченко Кирилл Владимирович. — История становления и развития ортопедической стоматологии в системе высшего медицинского образования в Республике Татарстан (Автореферат) (25.10.2018)

Нечаев Олег Игоревич. — Становление пермской хирургической научной школы академика Е.А. Вагнера (Автореферат) (27.09.2018)

Денисов Александр Павлович. — Медико-социальные аспекты формирования здоровья детей раннего возраста (Автореферат) (27.09.2018)

Саитгареев Руслан Ринатович. — Научное обоснование системы показателей для оценки эффективности деятельности медицинских организаций, оказывающих первичную медико-санитарную помощь, в условиях подушевого финансирования (Автореферат) (28.06.2018)

Старинская Мария Александровна. — Болезни системы кровообращения: нозологическая и демографическая структура смертности и потерянных лет жизни; факторы, оказывающие влияние на показатели смертности (Автореферат) (28.06.2018)

Москвина Яна Владимировна. — Организация обязательных мер медицинского характера и реабилитации наркозависимых лиц для профилактики повторных общественно опасных деяний (Автореферат) (24.05.2018)

Геворкян Ашот Рафаэлович. — Научное обоснование реструктуризации урологической службы муниципальных амбулаторно–поликлинических учреждений на принципах муниципально-частного партнерства (Автореферат) (24.05.2018)

Сороколетов Дмитрий Владимирович. — Организационно-методические аспекты качества восстановительного лечения трудоспособного населения с нарушениями опорно–двигательной системы (Автореферат) (26.04.2018)

Большов Иван Николаевич. — Научное обоснование повышения доступности стоматологической помощи сельскому населению с применением территориально-адаптированных организационных технологий (Автореферат) (22.03.2018)

Киясов Иван Андреевич. — Разработка мероприятий по совершенствованию первичной профилактики инфекций, передаваемых половым путем, среди молодежи в крупном промышленном городе (Автореферат) (08.02.2018)

Камаев Юрий Олегович. — Пути совершенствования организационных технологий оказания медицинской помощи детям раннего возраста, родившихся с экстремально низкой и очень низкой массой тела (Автореферат) (08.02.2018)

Значкова Елена Александровна. — Совершенствование организации первичной медико-санитарной помощи пациентам пожилого и старческого возраста, страдающим множественными хроническими заболеваниями (Автореферат) (08.02.2018)

Егиазарян Карен Альбертович. — Пути оптимизации организации травматологической помощи в Российской Федерации (Автореферат) (28.12.2017)

Гаджиева Саида Мердановна. — Научное обоснование норм труда медицинских работников в санаториях для детей (Автореферат) (30.11.2017)

Валеев Зуфар Гайсанович. — Организационная технология повышения качества медицинской помощи больным при экстренной госпитализации (Автореферат) (30.11.2017)

Зудин Александр Борисович. — Научное обеспечение реформирования здравоохранения России (Автореферат) (28.09.2017)

Устинова Ольга Ивановна. — Научное обоснование системы экспресс-диагностики оценки состояния здоровья населения (Автореферат) (27.09.2017)
На основании личного заявления Устиновой О.И. диссертационный совет снял диссертацию с рассмотрения

Хорева Оксана Олеговна. — Совершенствование организации стоматологической помощи гражданам пожилого возраста и инвалидам, проживающим в организациях социального обслуживания (Автореферат) (27.09.2017)

Зеляева Наталия Васильевна. — Совершенствование организации медицинских осмотров в профилактике неинфекционных заболеваний работников промышленных предприятий (Автореферат) (27.09.2017)

Лалабекова Марина Валерьевна. — Научное обоснование использования информационного обеспечения в совершенствовании планирования первичной медико-санитарной помощи (Автореферат) (27.06.2017)

Дружинин Владимир Юрьевич. — «Чарака-самхита»: история формирования, структура, учения и современное значение (Автореферат) (25.05.2017)

Удовиченко Олег Викторович. — Научное обоснование совершенствования организации амбулаторной медицинской помощи больным с поздними осложнениями сахарного диабета (Автореферат) (30.03.2017)

Теринова Виталия Владимировна. — Заболеваемость ишемической болезнью сердца в трудоспособном возрасте и сравнительная оценка результативности маршрутов реабилитации (Автореферат) (28.02.2017)

Кондратова Наталья Владимировна. — Научное обоснование обеспечения качества и безопасности медицинской деятельности на основе внедрения комплексной системы стандартизации в медицинской организации (Автореферат) (28.02.2017)

Русановская Галина Федоровна. — Научное обоснование совершенствования организации медицинской помощи женщинам репродуктивного возраста, больным туберкулёзом органов дыхания, на муниципальном уровне (Автореферат) (22.12.2016)

Шамсияров Нурихан Нурисламович. — Социально-гигиенический мониторинг здоровья населения мегаполиса в период социально-экономических реформ (Автореферат) (22.12.2016)

Колядо Елена Владимировна. — Научное обоснование организационно-методического сопровождения управления медицинской деятельностью на уровне субъекта Российской Федерации (Автореферат) (22.12.2016)
На заседании 22 декабря 2016 года диссертационный Совет принял отрицательное решение по диссертации Колядо Е.В.

Долгова Ирина Генриховна. — Современные научные подходы к управлению региональной системой организации офтальмологической помощи на основе процессного подхода (Автореферат) (27.10.2016)

Иванова Альбина Аммосовна. — Региональные особенности преждевременной смертности населения Республики Саха (Якутия) и оценка экономического ущерба (Автореферат) (27.10.2016)

Касаева Тереза Черменовна. — Перспективные направления совершенствования стационарозамещающих технологий лечения больных туберкулезом (Автореферат) (29.09.2016)

Кущ Оксана Васильевна. — Научное обоснование совершенствования организации специализированной медицинской помощи при остром коронарном синдроме (Автореферат) (29.09.2016)

Атамбаева Раиса Минахмедовна. — Медико-социальные аспекты формирования и охраны репродуктивного здоровья девушек-подростков Кыргызской Республики (Автореферат) (05.06.2016)

Гайдук Сергей Викторович. — Основные направления совершенствования управления деятельностью сети ведомственных санаторно-курортных учреждений (Автореферат) (05.06.2016)

Огнева Екатерина Юрьевна. — Основные направления совершенствования системы показателей для планирования муниципального здравоохранения (Автореферат) (26.05.2016)

Нагаев Ринат Явдатович. — Медико-социальные аспекты охраны здоровья подростков 10-17 лет на уровне субъекта Российской Федерации (Автореферат) (26.05.2016)

Кытманова Лилия Юрьевна. — Совершенствование организационных технологий формирования приверженности диспансерному наблюдению больных ВИЧ-инфекцией (Автореферат) (31.03.2016)

Шишкин Евгений Владимирович. — Совершенствование организации и повышение эффективности медицинской помощи пострадавшим в дорожно-транспортных происшествиях на региональном уровне (Автореферат) (28.01.2016)

Белова Светлана Александровна. — Научное обоснование совершенствования организации медицинской помощи при ишемической болезни сердца на региональном уровне (на примере Челябинской области) (Автореферат) (26.11.2015)

Григорьев Геннадий Иванович. — Медико-социальное исследование рискованного и опасного потребления алкоголя врачами различных специальностей (распространенность, факторы риска, профилактика) (Автореферат) (29.10.2015)

Гриднев Олег Владимирович. — Научное обоснование повышения качества организации первичной медико-санитарной помощи в г. Москве (Автореферат) (29.10.2015)

Назаров Файзали Насруллоевич. — Медико-социальные аспекты эндохирургии в Республике Таджикистан и перспективы ее развития в новых социально-экономических условиях (Дополнительное заключение по диссертации) (Автореферат) (30.06.2015)
На заседании 30 июня 2015 года по заявлению соискателя диссертация снята с рассмотрения до проведения тайного голосования.

Иванец Николай Валерьевич. — Научное обоснование совершенствования управления деятельностью централизованной клинико-диагностической лаборатории (Автореферат) (30.06.2015)

Паренькова Ольга Рудольфовна. — Становление общемедицинского направления в стоматологическом образовании: история кафедры внутренних болезней Московского стоматологического института (1937-1997 гг.) (Автореферат) (29.04.2015)

Масякин Антон Валерьевич. — Медико-социальные факторы риска летальности больных шизофренией в психиатрических больницах и разработка мероприятий по снижению их влияния (Автореферат) (29.04.2015)

Князюк Надежда Феофановна. — Научно-методические основы повышения эффективности управления медицинскими организациями в современных условиях (Дополнительное заключение по диссертации) (Автореферат) (26.03.2015)

Эрк Алексей Алоисович. — Совершенствование организации профилактической стоматологической помощи школьникам (Автореферат) (26.02.2015)

Ахмадов Тахуз Зайндиевич. — Становление и развитие врачебно-санитарного дела на Северо-Восточном Кавказе (XIX в. – 1940 г.) (Автореферат) (26.02.2015)

Дьячкова Анна Сергеевна. — Совершенствование обеспечения и организации оказания первичной специализированной медико-санитарной помощи взрослому городскому населению (Автореферат) (29.01.2015)

Суботялов Михаил Альбертович. — Традиционная аюрведическая медицина: источники, история и место в современном здравоохранении (Автореферат) (29.01.2015)

Казанцева Маргарита Викторовна. — Научное обоснование совершенствования профилактики и раннего выявления онкологических заболеваний (Автореферат) (29.01.2015)

Кучин Никита Евгеньевич. — Медико-социальная оценка психического здоровья молодежи призывного возраста и совершенствование информационного обеспечения военно-врачебной экспертизы (Автореферат) (25.12.2014)

Карякин Николай Николаевич. — Научное обоснование путей повышения эффективности управления медицинской помощью в условиях разграничения полномочий между уровнями власти (Автореферат) (25.12.2014)

Киясова Елена Валерьевна. — Становление и развитие кафедр анатомии и гистологии Казанского университета (Автореферат) (30.10.2014)

Киндаров Заур Баронович. — Научное обоснование совершенствования организации нейрохирургической помощи в субъекте Федерации (Автореферат) (25.09.2014)

Тополянский Алексей Викторович. — Московские научные терапевтические школы (20-е – 40-е годы 20 века) и их роль в становлении кафедр внутренних болезней в МСИ – МГМСУ (Автореферат) (27.06.2014)

Богопольский Павел Майорович. — История реконструктивной хирургии пищевода в России (Автореферат) (27.06.2014)

Гололобова Татьяна Викторовна. — Научное обоснование совершенствования обеспечения эпидемиологической безопасности медицинской деятельности (Автореферат) (27.06.2014)

Лысенков Иван Иванович. — Научное обоснование совершенствования деятельности по выявлению и устранению факторов риска основных неинфекционных заболеваний (на примере Республики Коми) (Автореферат) (26.06.2014)

Федотов Александр Юрьевич. — Научное обоснование направлений совершенствования организации специализированной амбулаторной помощи онкологическим больным (Автореферат) (26.06.2014)

Безмельницына Людмила Юрьевна. — Научное обоснование совершенствования организации медицинской помощи детям с ревматическими заболеваниями (Автореферат) (30.05.2014)

Яхьяева Зульфия Идрисовна. — Основные направления развития акушерско-гинекологической помощи на Северном Кавказе в XIX-XX вв. (Автореферат) (30.05.2014)

Нисан Белла Александровна. — Научное обоснование организационных подходов к государственно-частному партнерству в здравоохранении (Автореферат) (30.05.2014)

Стволыгин Андрей Владимирович. — Пути повышения медицинской информированности пациентов частной стоматологической медицинской организации (Автореферат) (25.04.2014)

Томчук Андрей Леонидович. — Стратегическое планирование диагностической помощи на основе распространенности патологии среди населения (Автореферат) (25.04.2014)

Плутницкий Андрей Николаевич. — Научно-методическое обоснование определения приоритетных направлений развития здравоохранения территории (Автореферат) (24.04.2014)

Эфрос Лидия Александровна. — Роль информационных технологий в организации медицинской помощи пациентам кардиохирургического профиля (Автореферат) (24.04.2014)

Бетехтин Михаил Сергеевич. — Развитие европейских дерматовенерологических школ и их роль в становлении дерматовенерологии в россии (XIX – начало XX вв.) (Автореферат) (18.12.2013)

Единарова Ирина Евгеньевна. — Пути совершенствования консультативной медицинской помощи в условиях стационара гериатрического профиля (Автореферат) (18.12.2013)

Лысиков Игорь Вячеславович. — Научное обоснование информационного обеспечения диспансеризации по материалам детей, находящихся в трудной жизненной ситуации (Автореферат) (18.12.2013)

Абдильманова Бибигуль Рахманкуловна. — Научное обоснование совершенствования организации медицинской помощи больным с острыми нарушениями мозгового кровообращения в республике Казахстан. (Автореферат) (28.11.2013)

Румянцева Анна Ивановна. — Заболеваемость с временной утратой трудоспособности в Республике Саха (Якутия) и ее медико-экономическая характеристика (Автореферат) (31.10.2013)

Растегаева Ирина Николаевна. — Научное обоснование повышения роли диспансеризации в охране здоровья беременных женщин и родильниц (Автореферат) (26.09.2013)

Ломакина Елена Алексеевна. — Научное обоснование совершенствования управления обеспечением медикаментами пациентов в стационаре (Автореферат) (27.06.2013)

Улумбекова Гузель Эрнстовна. — Научное обоснование направлений развития здравоохранения РФ на среднесрочный период (Автореферат) (30.05.2013)

22 мая 2014 года проведено заседание Диссертационного Совета по вопросу о присуждении ученой степени доктора медицинских наук Улумбековой Гузель Эрнстовне. (Президиум ВАК при Минобрнауки России принял положительное заключение и рекомендует Министерству образования и науки Российской Федерации представить кандидатскую диссертацию Улумбековой Гузель Эрнстовны к защите на соискание ученой степени доктора медицинских наук).

На заседании 22 мая 2014 года Диссертационный совет принял решение присудить Улумбековой Г.Э. ученую степень доктора медицинских наук.

При проведении тайного голосования Диссертационный Совет в количестве 20 человек, из них 13 докторов наук по шифру 14.02.03 — общественное здоровье и здравоохранение, участвовавших в заседании, из 27 человек, входящих в состав совета, проголосовали: за — 18, против — 2, недействительных бюллетеней — нет.

Дуйко Виктор Васильевич. — Основные направления организации медико-социальной помощи больным лепрой в современных условиях (Автореферат) (30.05.2013)

Агамов Загир Хидирович. — Социально-гигиенические и организационные аспекты совершенствования диспансеризации населения в городской поликлинике города Москвы (Автореферат) (28.03.2013)

Согияйнен Александр Алексеевич. — Оптимизация медицинского обеспечения подготовки и призыва на военную службу (Автореферат) (31.01.2013)

Карпов Дмитрий Александрович. — Пути совершенствования профилактики заболеваний у трудовых мигрантов в условиях Севера России (Автореферат) (31.01.2013)

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему: Органосохраняющее хирургическое лечение рака молочной железы с применением онколитического вируса болезни Ньюкасла

Органосохраняющее хирургическое лечение рака молочной железы с применением онколитического вируса болезни Ньюкасла - диссертация, тема по медицине

Автореферат диссертации по медицине на тему Органосохраняющее хирургическое лечение рака молочной железы с применением онколитического вируса болезни Ньюкасла

На правах рукописи

ПОДОЛЬСКАЯ Мария Владимировна

ОРГАНОСОХРАНЯЮЩЕЕ ХИРУРГИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ПРИМЕНЕНИЕМ ОНКОЛИТИЧЕСКОГО ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА

14.00.27 — хирургия 14.00.14 — онкология

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена на кафедре онкологии и рентгенорадиологии Российского университета дружбы народов

Научный руководитель: академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Владимир Петрович Харченко

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Святослав Ростиславович Добровольский

доктор медицинских наук

Владимир Михайлович Сотников

Российская медицинская академия последипломного образования

Защита диссертации состоится «_»_2009г._ в_часов

на заседании диссертационного совета Д. 212.203.09 при Российском университете дружбы народов (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РУДН (Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6)

Автореферат разослан « «_2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

В настоящее время в лечении рака молочной железы (РМЖ) достигнуты значительные успехи, в связи с этим все более актуальными являются вопросы повышения качества жизни больных, что обуславливает широкое внедрение органосохраняющих операций в клиническую практику. Рядом рандомизированных исследований показано, что объем хирургического вмешательства не влияет на продолжительность общей и безрецидивной выживаемости, а сочетание органосохраняющих операций с лучевой терапией позволяет снизить частоту развития локальных рецидивов до показателей, наблюдающихся после выполнения мастэктомии (Летягин В.П. с соавт., 2008).

Органосохраняющие и реконструктивно-пластические операции занимают главное место в реабилитации больных РМЖ и в настоящее время рассматриваются как этиотропное лечение психических расстройств, связанных с утратой женственности и целостности собственного органа (Асеев A.B., 1993).

Среди ряда факторов, ограничивающих возможности выполнения органосохраняющих операций, наиболее важным является размер первичной опухоли. Проведение неоадъювантной (предоперационной) терапии позволяет сократить размеры опухоли и дает возможность в ряде клинических ситуаций избежать выполнения мастэктомии.

Главными задачами неоадъювантной системной терапии (HCT) являются улучшение местного контроля болезни за счет подавления роста первичной опухоли, обеспечение возможности хирургической операции, сберегающей молочную железу, и теоретически уничтожение отдаленных микромегастазов (Fisher В. et al., 2007). HCT является стандартом в лечении местнораспространенной формы РМЖ, и в настоящее время исследуются ее показания в отношении ранних форм операбельного заболевания (Carlson RW,2007, Sparano J. et al., 2009).

Несмотря на успехи в лечении РМЖ, проблема резистентности злокачественной опухоли к консервативным методам лечения остается не решенной, что является предпосылкой поиска и создания новых концепций HCT. Активное развитие молекулярной биологии, изучение механизмов канцерогенеза, иммунологии опухолей и выявление новых терапевтических мишеней создают возможности для повышения эффективности традиционных схем лечения РМЖ.

Одним из перспективных направлений клинической онкологии является использование в лечении злокачественных новообразований вирусов, в том числе вируса болезни Ньюкасла (ВБН). Впервые для лечения злокачественных новообразований ВБН использован в 1964 году. Противоопухолевая активность ВБН доказана многочисленными лабораторными и клиническими исследованиями в США, Германии,

Венгрии (Schirrmacher V. et al 2000). Результаты II-III фазы исследований показывают увеличение безрецидивной выживаемости, высокий уровень объективного ответа, хорошую переносимость и безопасность при лечении больных меланомой, раком молочной железы, почки, шейки матки, легких, колоректальным раком (Ahlert Т., 2003, Харченко В.П. с соавт., 2008). По данным пилотных клинических исследований применение терапии ВБН на 15-30% эффективнее, чем стандартное химиотерапевтическое воздействие (Phuangsab А., 2005).

изучить возможности органосохраняющего хирургического лечения рака молочной железы после проведения неоадъювантной терапии с применением вируса болезни Ныокасла.

1. Оценить особенности выполнения органосохраняющих операций у больных после проведения неоадъювантной терапии с применением вируса болезни Ныокасла.

2. Изучить течение послеоперационного периода, косметический эффект после органосохраняющего лечения у больных, которым проведена неоадыовантная терапия с включением вируса болезни Ньюкасла.

3. Изучить непосредственные результаты неоадъювантной терапии рака молочной железы с применением вируса болезни Ньюкасла.

4. Исследовать профиль токсичности вируса болезни Ньюкасла применяемого как в монорежиме, так и в сочетании с неоадъювантной лекарственной терапией.

Разработана и апробирована в клинических условиях новая методика органосохраняющего лечения рака молочной железы, с использованием вируса болезни Ньюкасла. Впервые в нашей стране изучены непосредственные результаты применения вируса болезни Ньюкасла в неоадъювантной терапии рака молочной железы. Изучен профиль токсичности вируса болезни Ньюкасла применяемого как в монорежиме, так и в сочетании с химиотерапией.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования в клиническую практику

Практическому здравоохранению для повседневного использования предлагается новая методика органосохраняющего лечения рака молочной железы после проведения неоадъювантной терапии с применением вируса болезни Ньюкасла. Разработанный алгоритм лечения характеризуется

высокой эффективностью и безопасностью, способствует повышению качества жизни больных и создает оптимальные условия для психологической и социальной адаптации. Предложенная методика внедрена в клиническую практику в хирургическом отделе Российского научного центра Рентгенорадиологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Применение вируса болезни Ньюкасла в неоадъювантной терапии рака молочной железы создает условия для выполнения органосохраняющих операций с хорошим косметическим эффектом, не влияет на течение послеоперационного периода и частоту развития послеоперационных осложнений.

2. Общая эффективность лечения у больных получивших комбинацию вируса болезни Ньюкасла с химиотерапией составила 48,5%, против 34,3% в контрольной группе, а частота достижения 3-4 степени терапевтического патоморфоза 57,1% и 40% соответственно.

3. Применение вируса болезни Ньюкасла не вызывает серьезных побочных явлений и удовлетворительно переносится. При комбинированном применении ВБН и химиотерапии частота развития нейтропении достоверно меньше, чем в контрольной группе

Апробация материалов диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на совместном заседании кафедры онкологии и рентгенорадиологии Российского университета дружбы народов и научно-практической конференции Российского научного центра Рентгенорадиологии, конференции с международным участием «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии».

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, приложений, библиографического указателя, включающего 40 отечественных и 199 зарубежных авторов. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 1 схему, 26 таблиц, иллюстрирована 34 рисунками.

Материалы и методы

Основу работы составили результаты комплексного обследования и лечения 105 больных РМЖ стадий T1.2N0.2M0, наблюдавшихся в ФГУ «РНЦРР Росмедтехнологий» в 2006-2008 годах. Возраст больных варьировал от 28 до 69 лет, в среднем составил 50±4,7 лет. Больные распределены по трем группам, каждая из которых включала 35 человек. Дизайн работы представлен на схеме 1.

Основные критерии включения в исследование:

• гистологическое подтверждение диагноза

• отсутствие раннее проводимой терапии по поводу рака молочной железы (за исключением случаев метахронного рака)

• возраст 18-70 лет

• адекватные показатели гематологического и метаболического статуса '

• отсутствие тяжелых соматических заболеваний, аутоиммунных процессов, системных инфекций (гепатит В, гепатит С, ВИЧ инфекция)

• статус по шкале ЕССЮ 0-1

Распределение по стадиям представлено в таблице 1. В группах А и С преобладали больные со ПВ стадией (Т^Т^Мо), в группе В у большинства диагностирована 1-ПА стадия (Т,.2 М0М0).

Стадия TNM Группа А Группа В Группа С

T,N,Mo 2 5,7 4 11,4 2 5,7

T2NOM0 1 2,9 18 51,4 2 5,7

T2N,MO 27 77,1 11 31,4 28 80,0

T2N2Mo 5 14,3 2 5,7 J 8,6

Всего: 35 100 35 100 35 100

Всем больным до начала лечения выполнялась биопсия опухоли системой пистолет-игла «Bard» или «Pro-mag» с использованием иглы калибром 12G под контролем рентгеностереотаксической приставки «Цитогайд» или под УЗИ-контролем. В биоптате определялись: гистологическая структура опухоли, степень ее злокачественности, иммуногистохимическим методом оценивалась экспрессия рецепторов стероидных гормонов, онкобелок Her-2/neu. Для подтверждения позитивного Нсг2-статуса методом флуоресцентной гибридизации in situ определялась амплификация гена Her-2/neu в образцах ткани РМЖ. В 71,4% случаев иммуногистохимически выявлен положительный статус рецепторов стероидных гормонов, у 36,1% больных выявлена экспрессия Her-2/neu. В выделенных группах достоверных различий по уровню экспрессии рецепторов стероидных гормонов, Her-2/neu не наблюдалось. Терапевтический патоморфоз в операционном материале оценивался по классификации H.H. Шиукашвили (1974г).

В группе В проводилось изучение иммунологического статуса в динамике, который оценивался по уровню экспрессии поверхностных антигенов на лимфоцитах периферической крови методом проточной цитофлюорометрии с использованием моноклональных антител.

Методика неоадъювантной (предоперационной') терапии с применением вируса болезни Ньюкасла (ВВН). Препарат ВБН изготавливался из живого вируса штамма La-Sota, безвредного для

млекопитающих и вакцинного для птиц (сертификат соответствия: № РОСС 1Ш. ФВ.В16890 7521468). Препарат ВБН в группах А и В в дозе 0,1 мл (10*9 микробных тел) вводился внутрикожно, в область передней брюшной стенки. В группе А инъекции ВБН выполнялись за 24 часа до начала химиотерапии (схема ЕС: эпирубицин 60 мг/м кв., циклофосфамид 600 мгЛ1 кв.), далее в интервалах между курсами еженедельно. В группе В препарат ВБН вводился с интервалом 4 дня. Продолжительность лечения составила: в группе В — 4 недели, в группах А и С 5-6 недель (что соответствовало 2 курсам химиотерапии).

Оценка эффективности лечения выполнялась в соответствии с критериями ЯЕСГйТ. Базовый размер опухоли определялся как сумма наибольших диаметров всех измеряемых очагов.

• Полный ответ — исчезновение всех опухолевых очагов.

• Частичный ответ — уменьшение измеряемых очагов на 30% или более.

• Прогрессирование — увеличение на 20 % наименьшей суммы всех очагов поражения или появление новых очагов.

• Стабилизация — нет уменьшения достаточного для оценки как частичного эффекта, или увеличения, которое можно расценить как прогрессирование.

Токсичность проводимого лечения оценивалась в соответствии со шкалой токсичности МС1С.

Методика хирургического лечения

После проведения неоадъювантной терапии всем 105 больным проведено хирургическое лечение: 76 больным выполнена мастэктомия по Маддену, 5 больным мастэктомия с различными вариантами реконструктивных вмешательств, 9 больным — квадрантэктомия с подмышечной лимфаденэктомией, 15 — квадрантэктомия с подмышечной лимфаденэктомиией и пластикой фрагментом большой грудной мышцы.

При выполнении квадрантэктомии ткань молочной железы удалялась в едином блоке с прилежащим участком фасции большой грудной мышцы и клетчаткой подмышечной, подключичной, подлопаточной областей. Иссечение ткани производилось по всей толще молочной железы, включая кожу над опухолью и фасцию, причем расстояние от опухоли до края резекции составляло не менее 3 см. Клетчатку удаляли из основного или, в случае медиальной локализации опухоли, дополнительного разреза в аксиллярной области. Если расстояние от края опухоли до ареолы не превышало 1 см, выполняли резекцию сосково-ареолярного комплекса.

При наличии косметического дефекта выполнялась пластика порцией большой грудной мышцы или использовались различные варианты алломаммопротезирования с использованием протеза марки МсСЬап.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты оценены в соответствии с критериями ЯЕОБТ с использованием современных клинико-рентгено-сонографических методов. Как представлено в таблице 2 общая эффективность лечения (сумма полного и частичного ответа) составила в группе А — 48,5 %, а в группе С-34,3%. В группе В у всех 35 больных отмечена стабилизация заболевания, увеличения размеров опухоли не отмечено.

Уровень объективного ответа, полученный в группах А, В и С

Объективный ответ Группа А %(п) Группа В %(п) Группа С %(п)

Полный ответ 5,7 (2)* — —

Частичный ответ 42,8 (15) — 34,3 (12)

Стабилизация 48,6 (17)* 100 (35) 60 (21)*

Прогрессирование 2,9(1) — 5,7 (2)

Всего: 100 (35) 100 (35) 100 (35)

После неоадъювантной терапии всем 105 больным проведено хирургическое лечение. Вопрос о возможности выполнения органосохраняющих и реконструктивно-пластических операций рассматривался индивидуально, согласно принципам онкологического радикализма с учетом желания пациентки.

В данной работе основные критерии оценки возможности выполнения органосохраняющей операции основывались на следующих факторах:

• Отсутствие мультицентрического роста и рассеянных микрокальцинатов при маммографии.

• Размер опухоли. Наиболее значимыми были не линейные размеры опухоли, а соотношение величины опухолевого узла и молочной железы.

• Возможность выполнения послеоперационной лучевой терапии.

• Желание самой пациентки сохранить молочной железу.

Частота органосохраняющих операций составила в группе А — 17,1% (6), в группе В — 42,8% (15), а в группе С — 8,6% (3). Типы выполненных операций представлены в таблице 3.

Реконструктивно-пластические вмешательства выполнены только в группах А и В у 8,6% (3) и 5,7% (2) соответственно. Таким образом, частота выполнения органосохраняющих и реконструктивно-пластических операций была достоверно выше в группах А и В.

Распределение типов операция по группам (р< 0,05)

Тип операции Группа А %(п) Группа В %(п) Группа С %(п)

Мастэктомия 74,2 (26) 51,4(18) 91,4(32)

Мастэктомия с одномоментной алломаммопластикой 5,7(2)

Мастэктомия с отсроченной алломаммопластикой 5,7 (2)

Подкожная мастэктомия с пластикой торакодорзальным лоскутом 2,9(1)

Квадрантэктомия с лимфаденэктомией 17,1 (6) 8,6 (3)

Квадрантэктомия с лимфаденэктомией и пластикой фрагментном большой грудной мышцы 17,1 (6) 25,7 (9)

Всего: 100 (35) 100 (35) 100 (35)

Квадрантэктомия с лимфаденэктомией и пластикой фрагментом большой грудной мышцы проведена у 17,1 % (6) в группе А и у 25,7% (9) в группе В. Данный вид пластики применялся при закрытии обширных дефектов, полученных в результате резекции ткани молочной железы. Квадрантэктомия с лимфаденэктомией в классическом варианте проведена у 17,1% (6) в группе В и 8,6% (3) в группе С.

Тот факт, что частота выполнения органосохраняющих операций в группе А намного превосходит группу С, возможно объясняется тем, что в группе А уровень объективного ответа достоверно выше, чем в группе С.

Среди больных, которым выполнено органосохраняющее лечение, в группе А полный ответ отмечен у 2 больных (33,3%), частичный — у 4 (66,7%); в группе В у всех 17 больных выявлена стабилизация заболевания, а в группе С у всех трех больных — частичный ответ.

Средний возраст больных, которым выполнены органосохранягощие операции составил 46,2±3,7 лет. Стоит отметить, что возраст больных не являлся ключевым фактором, оказывающим влияние на выбор органосохраняющего лечения. Однако, по мнению ряда авторов, возраст моложе 35 лет расценивается как неблагоприятный прогностический фактор (Van der Hage J.A с соавт., 2003), в связи с чем, больным данной возрастной группы мы рекомендовали проведение мастэктомии.

У четырех больных после проведения неоадъювантной терапии с применением ВБН органосохраняющий вариант лечения включал подкожную мастэктомию с пластикой эндопротезом марки McGhan. В группе В двум больным выполнена мастэктомия с одномоментной алломаммопластикой, в группе А двум больным проведена мастэктомия с отсроченной алломаммопластикой и одной больной — подкожная мастэктомия с пластикой торакодорзальным лоскутом.

В зависимости от размеров реконструктируемой молочной железы стиль протеза подбирали в соответствии с показателями профильности (отношение профиля протеза к диаметру). Диапазон объемов используемых имплантов составил от 200 до 280 кубических см.

Методика операции включала следующие этапы. Окаймляющим опухоль разрезом рассекали кожу и подкожную клетчатку. После отсепаровки кожных лоскутов выполнялась подкожная мастэктомия в едином блоке с клетчаткой подлопаточной, межмышечной, аксиллярной и подлопаточных областей. После выполнения подкожной мастэктомии с лимфаденэктомией узловыми швами атравматической нитью формировали ложе для протеза. В одном случае лимфаденэктомия выполнена из отдельного доступа. Протез устанавливался в сформированное ложе на большую грудную мышцу. Ложе протеза дренировали двумя полихлорвиниловыми дренажами, установленными латерально и медиально. Подкожную клетчатку и кожу ушивали узловыми швами атравматическим материалом.

Отсроченная реконструкция молочных желез проводилась через 6-12 месяцев после окончания комплексного лечения. К этому времени окончательно формируются рубцы, стихают местные лучевые реакции и более четко формируются требования, которые пациентка предъявляет к реконструкции. У двух больных выполнена отсроченная реконструкция молочной железы с применением экспандера. На первом этапе отсроченной реконструкции экспандер устанавливали под кожу на большую грудную мышцу в специально сформированный карман. Через две недели после операции и далее в течение 3-х месяцев экспандер наполняли физиологическим раствором, за одну манипуляцию вводили не более 100 мл. Конечный объем раствора, введенного в экспандер, превышал объем предполагаемого импланта на 10 %.

Спустя 3-4 месяца проводился второй этап отсроченной реконструкции молочной железы — замена экспандера на эндопротез. В сформированный экспандером карман устанавливался геленаполненный имплант.

Во время выполнения операций особенностей, связанных с характером и длительностью неоадъювантной терапии не выявлено. Объем кровопотери составил от 50 до 120 мл. Продолжительность квадрантэктомии варьировала от 30 до 75 минут в среднем 48±7 минут.

Проведенное неоадъювантное лечение не влияло на течение послеоперационного периода. Показано, что после проведения органосохраняющего лечения, отмечена относительно большая, чем после мастэктомии, физическая активность с первых суток послеоперационного периода, а так же меньшая потребность в применении анальгетических препаратов.

Средняя продолжительность лимфореи в группе больных, после выполнения квадрантэктомии составила — 14,3±3,6 дней, различий по группам не наблюдалось.

Случаев нагноений послеоперационной раны не отмечено ни в одной из групп. У одной пациентки из группы В, которой проведена подкожная мастэктомия с одномоментной алломаммопластикой, развился краевой некроз кожного лоскута, однако благодаря проводимой консервативной терапии это осложнение существенно не отразилось на косметическом эффекте. Нарушения чувствительности после проведения квадрантэктомии отмечались у 65% (17) больных, различий по группам не наблюдалось. Из соматических осложнений следует отметить 2 случая (по одному в группах А и В) развития острого тромбофлебита поверхностных вен голени.

После выполнения квадрантэктомии косметический эффект оценен как отличный в четырех случаях (всем больным проведена пластика фрагментом большой грудной мышцы), хороший — у 19 больных, удовлетворительный у 3 больных, что было обусловлено большим объемом удаляемых тканей.

Мастэктомия с различными вариантами реконструкции выполнена у 5 больных, из них у 2-х косметический эффект оценен как очень хороший, у 3-х больных (при одномоментной пластике) как хороший.

Проведение реконструктивных вмешательств не препятствовало реализации программы послеоперационного лечения. Таким образом, неоадъювантная терапия РМЖ с применением ВБН представляется высокоэффективным и безопасным методом лечения, создающим предпосылки для выполнения хирургических вмешательств, сохраняющих молочную железу.

Наиболее значимым критерием ответа опухоли на проводимое лечение, является степень терапевтического патоморфоза, определяемая

при гистологическом исследовании операционного материала. При сравнении патоморфоза в группах А и С получены следующие результаты (таблица 4).

Степень терапевтического патоморфоза в группах А и С

Терапевтический Группа А Группа С

Всего: 100 (35) 100 (35)

Таким образом, частота достижения 3-4 степени терапевтического патоморфоза в группе А составляет 57,1%, тогда как в группе С — 40%. Результаты статистически достоверны (р=0,033).

В группе В 4 степень терапевтического патоморфоза диагностирована у 2,9%(1), 3 степень — 5,7%(2), 2 степень- 42,8% (15), 1 степень- 11,4% (4), отсутствие патоморфоза выявлено у 37,1% (13).

При клиническом ответе, расцененном как стабилизация, патоморфоз 4 степени отмечен в группе А у 8,6% (3), в группе С- у 2,9% (1), 3 степени — 20% (7) и 14% (5) соответственно. Результаты исследования подтверждают, что полный патоморфологический ответ не во всех случаях соответствует клиническому. Таким образом, для оценки эффективности неоадъювантной терапии данных, полученных при стандартном клиническом обследовании не достаточно, обязательно должен быть применен весь комплекс патоморфологических и иммуногистохимических методов.

Четкой корреляции полученного уровня объективного ответа от стадии заболевания нами не выявлено. В связи с этим можно предположить, что эффективность проводимой терапии определяется не только стадией заболевания, но и рядом других факторов, к которым можно отнести наличие в опухоли рецепторов стероидных гормонов, уровень экспрессии Нег-2/пеи.

При наличии экспрессии рецепторов стероидных гормонов общая эффективность лечения в группе А составила 52,1 %, в группе С — 36%, а при отсутствии рецепторов стероидных гормонов — 41,6% и 50% соответственно (таблица 5).

Частота объективного ответа в группах гормонональнозависимого и гормононегативного рака, при наличии _и отсутствии экспрессии Нег-2/пеи в группах А и С_

Фенотип опухоли Группа А %(п) Группа С %(п)

Гормональнозависимый 52,1 (12) 36,0 (9)*

Гормональнонезависимый 41,6 (5) 50,0 (5)*

Her-2/neu «+» 38,5 (5)* 28,6 (4)*

Her-2/neu «-» 54,5 (12)* 47,6 (10)*

Таким образом, результаты работы подтверждают данные Anderson с соавт., согласно которым при проведении неоадъювантной терапии РМЖ более высокий уровень клинического ответа наблюдается у больных с отсутствием экспрессии стероидных гормонов. В группах А и С уровень объективного ответа достоверно чаще наблюдался при отсутствии рецепторов Her-2/neu.

В группе В при наличии экспрессии рецепторов стероидных гормонов частота терапевтического патоморфоза 2-4 степени составила — 66,7%, а при отсутствии — 50,0 %. Так же как в группах А и С терапевтический патоморфоз в группе В был более выражен при отсутствии экспрессии Her-2/neu.

При гистологическом исследовании операционного материала метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов в группе А выявлено в 88,6% (31), в группе В — 51,4% (18), в группе С в 91,4 % (32). В группе А патоморфоз 3-4 степени в лимфатических узлах отмечался достоверно чаще и составил 25,8%(8), а в группе С — 5,6% (5). При патоморфологическом исследовании терапевтический патоморфоз в лимфатических узлах менее выражен, чем в первичной опухоли.

При сравнении степени терапевтического патоморфоза в подгруппах В1 и В2 получены следующие результаты.

Степень терапевтического патоморфоза в подгруппах В1 и В2

Степень терапевтического Патоморфоза Подгруппа В1 %(п) Подгруппа В2 %(п)

Отсутствие патоморфоза 35 (7) 40(6)

1 степень 10(2) 6,7(1) .

2 степень 45 (9) 46,7 (7)

3 степень 5(1) 6,7(1)

Всего: 100 (20) 100(15)

Достоверных различий в эффективности внутритуморального введения ВБН перед внутрикожным не получено, однако показано, что при внутритуморальном пути введения ВБН для достижения терапевтического действия необходимо меньшее количество инъекций.

В группе В у 30 больных исследована динамика показателей иммунологического статуса (таблица 7).

Динамика показателей иммунологического статуса в группе В (р>0,05)

Показатель Маркер До лечения (%) После лечения(%)

Т-лимфоциты СЦЗ 70,93±12,72 74,97±6,24

Т-хелперы С03С04 48,55±4,71 52,65±8,34

Т-киллеры/Т- СБЗС08 31,85±4,65 42,27±6,99

В-лимфоциты СБ19 12,38±5,02 14,10±4,63

К'К-лимфоциты СБ 16+56 8,24±2,84 9,25±2,76

Т-лимфоциты СБЗ СБ 16+СБ56 6,07±2,98 6,27±2,43

НЬАОЛ НЬА1Ж 4,76±2,1 4,42±1,13

СОЗ+НЬАОЯ СБЗ+НЬАОЯ 1,99±027 2,98±0,57

Показано, что на фоне проведения монотерапии ВБН у 70% (21) больных отмечено повышение уровня СОЗСЭ8 (Т-киллеры/супрессоры), у 30 % (9) — СШ9 (В лимфоциты).

В группах А, В и С до начала лечения и за сутки до операции исследовался уровень онкомаркеров СА-15.3, С А -125, РЭА, ХГЧ, аФП. Статистически достоверной корреляции между эффективностью лечения и уровнем онкомаркеров не выявлено.

Проведен анализ токсических реакций, возникших при проведении исследования. При применении ВБН отмечались следующие реакции: гипертермия, озноб, локальная кожная реакция, максимальная выраженность которых наблюдалась после первой инъекции. Таким образом, ВБН не обладает кумулятивной токсичностью, серьезных побочных явлений, связанных с его применением, не зафиксировано.

Гипертермия достоверно чаще наблюдалась в группе А, возникала, как правило, через 4-6 часов после введения ВБН и купировалась приемом жаропонижающих средств (аспирин, парацетамол). В группе В при изучении зависимости эффективности лечения от выраженности лихорадки показано, что максимальные показатели терапевтического патоморфоза отмечались при гипертермии 1 ст.

После внутрикожного введения ВБН во всех случаях наблюдалась локальная кожная реакция- папула с ободком гиперемии, незначительный

зуд. Диаметр зоны гиперемии оценивался через сутки после введения ВБН и варьировал от 10 до 70 мм, в среднем 23±8 мм.

Изучены токсические реакции, связанные с применением химиотерапии. Частота развития нейтропении в группе А составила 48,4 % (17), тогда как в группе С — 65,7% (23) (р<0,05). Достоверных различий по гастроинтестиналыюй токсичности в группах А и С не наблюдалось.

^■Применение вируса болезни Ньюкасла в неоадъювантной терапии рака молочной железы создает условия для выполнения органосохраняющих операций с хорошим косметическим эффектом, что способствует повышению качества жизни больных.

2. Включение вируса болезни Ньюкасла в неоадъювантный режим лечения больных раком молочной железы не влияет на течение послеоперационного периода и частоту развития послеоперационных осложнений.

3. Общая эффективность лечения у больных получивших комбинацию вируса болезни Ньюкасла с химиотерапией составила 48,5%, против 34,3% в контрольной группе, а частота достижения 3-4 степени терапевтического патоморфоза 57,1% и 40% соответственно.

4. Наличие признаков терапевтического патоморфоза у 62,9% (22) больных получавших монотерапию вирусом болезни Ньюкасла позволяет судить о его противоопухолевой активности.

5. Токсические реакции при проведении неоадъювантной терапии с применением вируса болезни Ньюкасла не превысили 1-2 степени и не повлияли на сроки проведения хирургического лечения.

6. При комбинированном применении вируса болезни Ньюкасла и химиотерапии показано увеличение частоты гипертермии, по сравнению с группой монотерапии вирусом болезни Ньюкасла, однако нейтропения в группе комбинированного применения вируса болезни Ньюкасла и химиотерапии встречалась достоверно реже, чем в контрольной группе.

1. Для повышения частоты выполнения органосохраняющих операций рекомендуется включение вируса болезни Ньюкасла в неоадъювантный режим лечения рака молочной железы.

2. Применение вируса болезни Ньюкасла в неоадъювантной терапии рака молочной железы с целью повышения непосредственных результатов лечения рекомендуется у больных, относящихся к группам низкого и среднего риска.

3. При проведении неоадъювантной химиотерапии рака молочной железы с применением вируса болезни Ньюкасла рекомендуется использовать колонестимулирующие факторы для повышения иммуногенности вируса болезни Ньюкасла и уменьшения частоты развития нейтропении.

4. Органосохраняющее лечение рака молочной железы с применением вируса болезни Ньюкасла должно включать этап лучевой терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Харченко В.П., Кешелава В.В., Добровольская Н.Ю., Чазова Н.Л., Берщанская А.М., Подольская М.В. Онколитический вирус болезни Ньюкасла в неоадъювантной терапии рака молочной железы //Хирург,- 2008.- №11. — С. 16-20.

2. Подольская М.В. Онколитический вирус болезни Ньюкасла в неоадъювантной терапии рака молочной железы // Сибирский онкологический журнал. — 2008. — Приложение №1.- С. 108

3. Подольская М.В. Неоадъювантная терапия рака молочной железы с применением онколитического вируса болезни Ньюкасла // Сборник тезисов конференции с международным участием «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии». -2008 — С. 67-69.

4. Кешелава В.В., Добровольская Н.Ю., Подольская М.В., Гармарник Т.В. Возможности применения онколитического вируса болезни Ньюкасла в неоадъювантной терапии рака молочной железы // Вестник Российской ассоциации радиологов. — 2009. — №1. — С. 171172.

5. Подольская М.В., Гармарник Т.В. Неоадъювантная иммунотерапия рака молочной железы онколитическим вирусом болезни Ньюкасла // Сибирский онкологический журнал. — 2009. — Приложение №1. — С. 156-157.

6. Кешелава В.В., Добровольская Н.Ю., Подольская М.В., Гармарник Т.В. Неоадъювантная терапия рака молочной железы с использованием онколитического вируса болезни Ньюкасла //Материалы Российской научно-практической конференции

«Реформа онкологической службы Уральского федерального округа и идеология развития позитронной эмиссионной томографии в регионах»,- 2009. — С. 79-80.

RECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) — критерии оценки

эффективности при лечении солидных опухолей

АФП — альфа фетопротеин

ВБН — вирус болезни Ньюкасла

НСТ- неоадъювантная системная терапия

РМЖ — рак молочной железы

РМЭ- радикальная мастэктомия

РЭА — раково-эмбриональный антиген

УЗИ — ультразвуковое исследование

ХГЧ — хорионический гонадотропин

Подольская М.В. (Россия) Органосохраняющее лечение рака молочной железы с применением онколитического вируса болезни Ньюкасла

Применение вируса болезни Ньюкасла (ВБН) в неоадъювантной терапии рака молочной железы создает благоприятные условия для проведения органосохраняющих операций, характеризующихся хорошим косметическим эффектом. ВБН по уровню эффективности и безопасности применения соответствует признанным стандартам специфической иммунотерапии опухолей. Полученные в работе данные позволяют проводить дальнейшие исследования терапевтического потенциала (ВБН) и разрабатывать оптимальные режимы и схемы лечения.

Podolskaya M.V. (Russia) Conservative surgery of a breast cancer with application oncolitic virus of Newcastle disease

Application of virus of Newcastle disease (NDV) in neoajuvant therapy of a breast cancer creates favorable conditions for carrying out conservative operations with good cosmetic effect. The NDV on level of efficiency and safety of application corresponds to recognizcd standards specific immunotherapy of tumors. The data obtained in work allows to conduct the further researches of therapeutic potential of NDV and to develop optimum modes and treatment schemes.

Подписано в печать: 17.09.2009

Заказ № 2521 Тираж — 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11 -й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Оглавление диссертации Подольская, Мария Владимировна :: 2009 :: Москва

Глава I. Обзор литературы.

1.1 Органосохраняющее лечение рака молочной железы.

1.2 Основные задачи и перспективы развития неоадъювантной лекарственной терапии рака молочной железы.

1.3 Перспективы применения вируса болезни Ньюкасла в онкологии.

Глава II. Материалы и методы.

2.1 Характеристика клинического материала.

2.2 Общая характеристика вируса болезни Ньюкасла.

2.3 Методика комплексного обследования.

2.4 Методика предоперационной (неоадъювантной) терапии с применением вируса болезни Ньюкасла.

2.5 Методика хирургического лечения.

2.6 Статистическая обработка данных.

Глава III .Результаты применения онколитического вируса болезни Ньюкасла в неоадъювантной терапии рака молочной железы.

3.1. Результаты комбинированного применения химиотерапии и вируса болезни Ньюкасла.

3.2 Результаты применения монотерапии вирусом болезни Ньюкасла.

Глава IV. Органосохраняющие и реконструктивно-пластические операции, выполненные после проведения неоадъювантной терапии с применением вируса болезни Ньюкасла.

4.1 Органосохраняющее лечение рака молочной железы после проведения неоадъювантной терапии с применением вируса болезни Ньюкасла.

4.2 Реконструктивно-пластические операции, выполненные после проведения неоадъювантной терапии с использованием вируса болезни Ньюкасла.

4.3 Особенности течения послеоперационного периода у больных, которым проведено органосохраняющее лечение после неоадъювантной терапии с применением вируса болезни Ньюкасла.

4.4 Оценка косметического эффекта при проведении органосохраняющих операций после неоадъювантной терапии с применением вируса болезни Ньюкасла.

Глава V. Токсические реакции.

5.1 Побочные явления, связанные с применением вируса болезни Ньюкасла.

5.2 Побочные явления, связанные с применением химиотерапии.

Введение диссертации по теме «Хирургия», Подольская, Мария Владимировна, автореферат

В настоящее время в лечении рака молочной железы (РМЖ) достигнуты значительные успехи, в связи с этим все более актуальными являются вопросы повышения качества жизни больных, что обуславливает широкое внедрение органосохраняющих операций в клиническую практику. Рядом рандомизированных исследований показано, что объем хирургического вмешательства не влияет на продолжительность общей и безрецидивной выживаемости, а сочетание органосохраняющих операций с лучевой терапией позволяет снизить частоту развития локальных рецидивов до показателей, наблюдающихся после выполнения мастэктомии [32,217].

Органосохраняющие и реконструктивно-пластические операции занимают главное место в реабилитации больных РМЖ и в настоящее время рассматриваются как этиотропное лечение психических расстройств, связанных с утратой женственности и целостности собственного органа [2,24].

Одним из наиболее важных факторов, ограничивающих возможности выполнение органосохраняющих операций является размер первичной опухоли. Проведение неоадъювантной терапии позволяет сократить размеры опухоли и дает возможность в ряде клинических ситуаций избежать выполнения мастэктомии.

Главными задачами неоадъювантной системной терапии (НСТ) являются улучшение местного контроля болезни за счет подавления роста первичной опухоли, обеспечение возможности хирургической операции, сберегающей молочную железу, и теоретически уничтожение отдаленных микрометастазов [7,103]. НСТ является стандартом в лечении местнораспространенной формы

РМЖ, и в настоящее время исследуются ее показания в отношении ранних форм операбельного заболевания [28,76] .

Несмотря на успехи в лечении РМЖ проблема резистентности злокачественной опухоли к консервативным методам лечения остается не решенной, и является предпосылкой поиска и создания новых концепций неоадъювантной системной терапии. Активное развитие молекулярной биологии, изучение механизмов канцерогенеза, иммунологии опухолей, выявление новых терапевтических мишеней создает возможности для повышения эффективности традиционных схем лечения РМЖ.

Одним из перспективных направлений клинической онкологии является использование в лечении злокачественных новообразований вирусов, в том числе вируса болезни Ньюкасла (ВБН). Впервые для лечения злокачественных новообразований ВБН использован в 1964 году [235]. Противоопухолевая активность ВБН доказана многочисленными лабораторными и клиническими исследованиями в США, Германии, Венгрии [145]. Результаты II-III фазы исследований показывают увеличение безрецидивной выживаемости, высокий уровень объективного ответа, хорошую переносимость и безопасность при лечении больных меланомой, раком молочной железы, почки, шейки матки, легких, колоректальным раком [49,81,68,142]. По данным пилотных клинических исследований применение терапии ВБН на 15—30% эффективнее, чем стандартное химиотерапевтическое воздействие [41].

Таким образом, повышение частоты выполнения органосохраняющих операций путем включения в схему неоадъювантной терапии ВБН, представляется актуальным.

Цель работы: изучить возможности выполнения органосохраняющего хирургического лечения рака молочной железы после неоадъювантной терапии с применением вируса болезни Ньюкасла.

Для реализации поставленной цели сформулированы задачи исследования:

1. Оценить особенности выполнения органосохраняющего лечения у больных после проведения неоадъювантной терапии с применением вируса болезни Ньюкасла.

2. Изучить течение послеоперационного периода, косметический эффект после выполнения органосохраняющих операций у больных, которым проведена неоадъювантная терапия с включением вируса болезни Ньюкасла.

3. Исследовать непосредственные результаты неоадъювантной терапии рака молочной железы с применением вируса болезни Ньюкасла.

4. Оценить профиль токсичности вируса болезни Ньюкасла применяемого как в монорежиме, так и в сочетании с неоадъювантной лекарственной терапией.

В результате исследования получены данные о возможности выполнения органосохраняющего лечения рака молочной железы после неоадъювантной терапии с применением онколитического вируса болезни Ньюкасла. Изучены непосредственные результаты клинического применения вируса болезни Ньюкасла в неоадъювантной терапии рака молочной железы. Исследован профиль токсичности вируса болезни Ньюкасла применяемого как в монорежиме, так и в сочетании с неоадъювантной лекарственной терапией.

Практическому здравоохранению для повседневного использования предлагается новая методика органосохраняющего лечения рака молочной железы после проведения неоадъювантной терапии с применением вируса болезни Ньюкасла. Разработанный алгоритм лечения характеризуется высокой эффективностью и безопасностью, способствует повышению качества жизни больных и создает оптимальные условия для психической и социальной адаптации.

Предложенная методика внедрена в клиническую практику в хирургическом отделе ФГУ «Российский научный центр Рентгенорадиологии». Результаты работы позволяют рекомендовать данную методику для практического применения в специализированных лечебных учреждениях — научно-исследовательских институтах, онкологических диспансерах, профильных стационарах.

Положения, выносимые на защиту

1. Применение вируса болезни Ньюкасла в неоадъювантной терапии рака создает условия для выполнения органосохраняющих операций с хорошим косметическим эффектом, не влияет на течение послеоперационного периода и частоту развития послеоперационных осложнений.

2. Общая эффективность лечения у больных получивших комбинацию вируса болезни Ньюкасла с химиотерапией составила 48,5%, против 34,3% в контрольной группе, а частота достижения 3-4 степени терапевтического патоморфоза 57,1% и 40% соответственно.

3. Применение вируса болезни Ньюкасла не вызывает серьезных побочных явлений и удовлетворительно переносится. При комбинированном применении вируса болезни Ньюкасла и химиотерапии частота развития нейтропении достоверно меньше, чем в контрольной группе.

Апробация материалов диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены 10 апреля 2009 г. на совместном заседании кафедры онкологии и рентгенорадиологии Российского университета дружбы народов и научно-практической конференции Российского научного центра Рентгенорадиологии.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, приложений, библиографического указателя, включающего 40 отечественных и 199 зарубежных авторов. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 1 схему, 26 таблиц, иллюстрирована 34 рисунками. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ. Материалы научно-практической конференции доложены на 2-х научно- практических конференциях.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.